Реакция с поверхностными антигенами клеток.

С помощью меченых антител можно обнаружить поверхностные антигены и выяснить их локализацию. Поскольку антитела проникают в живые клетки только путем эндоцитоза, обработка клеток мечеными антителами на холоду (для подавления эндоцитоза) приводит к окрашиванию именно поверхностных антигенов. Ранее был приведен пример маркирования поверхности В-лимфоцитов с помощью антииммуноглобулинов, меченных флуоресцентным красителем, показывает распределение антигенов на поверхности живых клеток щитовидной железы человека, выявляемое с помощью специфических аутоантител в непрямом тесте.

Если внимательно приглядеться к этим фотографиям, то можно заметить «пятнистое» распределение поверхностных антигенов.

рис. 27. Иммунофлуоресцентное окрашивание поверхности Ig В- клеток с использованием анти – Ig кнъюгированных с флуоресцеином. Поскольку реакцию проводят на холоду, чтобы предотвратить пиноцитоз, меченные антитела не могут проникнуть внутрь жизнеспособных лимфоцитов и взаимодействуют только с компонентами клеточной поверхности. Формирование « кэпа» на Лф.

Такое распределение наблюдается при использовании обычных двухвалентных антител. Если же обработать В-лимфоциты меченными флуоресцеином одновалентными Fаb - фрагментами антииммуноглобулинов, то флуоресцирующая метка распределяется равномерно по всей поверхности клетки. Это свидетельствует о том, что пятна возникают в результате микроагглютинации антигенов, а кроме того, указывает на подвижность антигенов в плоскости мембраны.

Большое впечатление производит тот факт, что при нагревании окрашенных клеток до 37°С комплексы антиген-антитело собираются в одно большое флуоресцирующее пятно, «кэп», на одном из полюсов клетки еще до начала эндоцитоза. После взаимодействия с антителами многие антигены удаляются с клеточной поверхности либо путем кэпинга и последующего эндоцитоза, либо просто «слущиваясь» в межклеточную среду в виде комплексов с антителами.

Удаление антигенов может иметь печальные последствия для организма-хозяина, поскольку в результате опухолевые или зараженные вирусами клетки могут приобрести устойчивость к цитотоксическому действию Т-лимфоцитов.

Проточная цитофлуориметрия.

Количество флуоресцирующих антител, связавшихся с каждой клеткой, можно измерить с помощью проточной цитофлуорографии. Предположим, мы окрасили субпопуляцию лимфоцитов специфическими антителами. Теперь можно создать упорядоченный поток клеток, проходящий через лазерный луч. Детектор света, расположенный под прямым углом к лазерному лучу, используется для определения интенсивности флуоресцентного сигнала. Одновременно другой детектор дает информацию о размерах данной клетки по светорассеянию. Например, количественные результаты, полученные с помощью клеточного сортера.

Рис. 28. Принцип работы проточного цитофлуориметра. Этот прибор используется для измерения флуоресценции окрашенных клеток (кружки, ограниченные красным) и разделения окрашенных неокрашенных клеток (серые кружки). Для фракционирования клеток по интенсивности флуоресценции или размерам они распределяются по каплям культуральной среды, которым сообщается разный заряд.

Рис. 29. Проточная цитофлуорография клеток селезенки мышей окрашенных одновременно меченными флуоресцеином анти- IgМ и меченными техасским красным анти - IgD. По осям - относительная интенсивность флуоресценции, а контуры указывают число клеток. В селезенке мышей линии /б/, дефектных по иммунореактивности на тимус- независимые антигены типа II, такие, как полисахарид пневмококка, отсутствует популяция клеток, на поверхности которых плотность молекул IgD) выше плотности молекул IgМ. Именно такие клетки обнаруживаются у животных линии /а/, нормально реагирующих на данные антигены. С помощью клеточного сортера, можно измерять и величину светорассеяния, по которой судят о размерах клеток и их жизнеспособности. Это позволяет исключать из рассмотрения погибшие клетки и анализировать интенсивность флуоресценции в зависимости от размера клеток.

Другие методы на основе меченых антител.

Помимо иммунофлуоресценции были разработаны методы, предусматривающие использование антител, меченных ферментами, такими, как пероксидаза или фосфатаза. Комплекс антител с ферментом можно выявить обычными гистохимическими методами как на уровне световой, так и электронной микроскопии. В последнем случае некоторую проблему представляют цитоплазматические антигены: с одной стороны, для проникновения антител в цитоплазму клетки должны быть повреждены, а с другой- во избежание нарушения морфологии внутриклеточных структур необходимо фиксировать ткань. Чем сильнее степень фиксации, тем труднее антителам перемещаться в цитоплазме.

Рис. 30. Электронно-микроскопическое выявление IgG человека на поверхности В-лимфоцитов путем обработки суспензии живых клеток анти-IgG, конъюгированными с пероксидазой. Обратите внимание на соседний немеченый лимфоцит.