Иммуноблоттинг (вестерн - блоттинг).

После разделения сложной смеси белков методом электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле их можно перенести из геля на микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител. Данный метод получил широкое распространение. Например, он используется для идентификации компонентов нейрофиламентов, которые предварительно разделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика использоваться не может. Если белки антисыворотки разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Индикация бактериальных антигенов.

Для экспресс - диагностики инфекционных болезней применяют разнообразные методы, выявляющие бактериальные Аг — компоненты клеточной стенки, жгутиков, капсул, ДНК, а также некоторые секреторные продукты (например, токсины). Из многих тестов наиболее распростра­нены и эффективны метод встречного электрофореза, реакция латекс-агглютинации и иммуно-ферментный метод.

Встречный иммуноэлектрофорез ─ разновидность реакции иммунопреципитации в агаровом, агарозном геле или на ацетат-целлюлозных мембранах; однако контакт обусловлен не свободной диффузией агентов, а эффектом постоянного электрического поля, что усиливает способность к взаимодействию низкореактогенных Аг и АТ. Накопление и преципитация комплекса между стартовыми лунками происходит в течение 30-180 мин. Основное условие для применения метода — наличие электрофоретической подвижности Аг, отличной от таковой у АТ. Основные достоинства метода — высокая чувствительность, в 10 раз превышающая чувствительность метода двойной иммунодиффузии по Ухтерлони, возможность индикащи Аг, не выявляемых методом диффузии, и скорость — результаты можно учитывать через 1-3 ч(для полноценной иммунодиффузии — через 24 ч). Недостатки метода — высокая стоимость трудность интерпретации и невозможность получить адекватные результаты при работе с некоторыми образцами.

Латекс-агглютинация. Принцип метода основан на взаимодействии Аг, присутствующего в образце, с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными АТ, что ведёт к образованию видимых агрегатов. Учёт результатов проводят через 10-15 мин при косом освещении на тёмном фоне. Разработаны коммерческие диагностикумы для индикации «стрептококка пневмонии» , стрептококков группы В. Недостатками метода являются достаточно высокая стоимость дигностикумов и возможность получения артефактов, особенно в присутствии ревматоидных факторов и продуктов фибринолиза.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип метода весьма напоминает метод радиоиммунологического анализа (РИА), но в его основу заложено маркирование ферментом Аг или АТ, вступающих в реакцию. Взаимодействие метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики и наибольшее распространение получил гетерогенный иммуноферментный анализ на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Коммерческие моноклональные АТ фиксируют на лунках пластиковых панелей, реже АТ иммобилизуют на пластиковых или металлических бусах либо на нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах. По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с АТ, а не анализировать вторцичные проявления — агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность — обычно достаточно присутствия Аг в концентрации 1 нг/мл.