Иммуногистохимия - определение локализации антигена в клетках и тканях.

Иммунофлуоресценция.

Флуоресцентные красители, такие, как флуоресцеин и родамин, можно химически пришить к антителам, не нарушая их специфичности. Как впервые показал Кунс, такие конъюгаты взаимодействуют с антигеном на срезе ткани и могут быть выявлены с помощью флуоресцентного микроскопа. При этом можно установить распределение антигена в тканях и клетках. С другой стороны, иммунофлуоресценция позволяет обнаружить антитела, направленные к известному антигену данной ткани или клетки.

Существуют три основных варианта постановки реакции иммунофлуоресценции.

1. Прямой иммунофлуоресцентный метод.

Используют антитела к тканевому антигену, конъюгированные, например, с флуорохромом. Представим себе, что нам захотелось установить тканевое распределение желудочного аутоантигена, реагирующего с аутоантителами, содержащимися в сыворотке больных злокачественной анемией. Нам следует выделить IgG из сыворотки больного, конъюгировать их с флуоресцеином и нанести на срез слизистой желудка, помещенный на предметное стекло. Используя флуоресцентный микроскоп, мы бы увидели яркое свечение цитоплазмы париетальных клеток.

Рис.25. Принципы иммунофлуоресцентного метода для идентификации тканевых антигенов или соответствующих антител. Красные кружки -флуоресцеиновая метка.

С помощью антисывороток, конъюгированных с красителями, флуоресцирующими при различных длинах волн, можно одновременно на одном и том же препарате выявлять два различных антигена. Прямое окрашивание фиксированных плазматических клеток смесью анти- IgG и анти- IgМ, меченных родамином и флуоресцеином соответственно, убедительно показывает, что антитела этих двух классов синтезируются различными клетками. В настоящее время широкое распространение получают маркирование антител биотином и последующее его выявление с помощью флуоресцентно меченного авидина.

2. Непрямой иммунофлуоресцентный метод.

Данный вариант метода заключается в том, что немеченые антитела наносят непосредственно на срез ткани, а затем выявляют их с помощью конъюгированного с флуорохромом антиглобулинового реагента. Если бы нам захотелось таким образом выяснить, образуются ли у больного антитела к париетальным клеткам желудка, то мы бы сначала обработали препарат ткани желудка исследуемой сывороткой, а затем после тщательного отмывания меченными флуоресцеином антителами к иммуноглобулинам человека. Если в сыворотке содержатся антитела, то париетальные клетки окрасятся.

Рис. 26. Окрашивание париетальных клеток желудка антителами, меченными флуоресцеином (а) или пероксидазой. Срезы были последовательно обработаны аутоантителами человека к париетальным клеткам, а затем конъюгированными с меткой кроличьими антителами к IgG человека. Фермент выявляли стандартной реакцией на пероксидазу.

Этот вариант имеет несколько преимуществ.

Во-первых, флуоресценция в этом случае гораздо ярче, чем в прямом тесте, поскольку к каждой молекуле антитела первого слоя присоединяется несколько молекул флуоресцирующих антииммуноглобулинов.

Во-вторых, поскольку процесс конъюгации довольно продолжителен, то при необходимости тестирования набора сывороток экономится много времени, так как следует получать только один меченый реагент, а именно антииммуноглобулин.

В-третьих, метод имеет несколько модификаций. Например, используя конъюгаты антисывороток к индивидуальным тяжелым цепям иммуноглобулинов, можно по крайней мере полуколичественно оценить распределение антител по классам и подклассам.

В-четвёртых, на срезе ткани можно оценить и связывание комплемента, добавляя смесь первых антител и источника комплемента, а затем в качестве «второго слоя» - флуоресцирующие антитела к комплементу.

В-пятых. Чувствительность метода еще более повышается при использовании третьих антител. Например, препарат ткани желудка можно последовательно обработать следующими реагентами: сывороткой больного, содержащей антитела к антигенам париетальных клеток, затем антителами кролика к IgG человека и, наконец, конъюгированными с флуоресцеином козьими антителами к IgG кролика.

Однако, как и в большинстве других иммунологических методов, если увеличивается чувствительность, то уменьшается специфичность, и поэтому требуется тщательная постановка контролей.

3. Метод сандвича.

Данный метод разработан для выявления специфических антител. Если, например, надо узнать, какое количество клеток в препарате лимфоидной ткани синтезируют антитела к полисахариду пневмококка, то следует зафиксировать клетки этанолом для предотвращения потери антител в ходе последующей обработки, а затем проинкубировать их с раствором антигена. После отмывания необходимо добавить меченные флуоресцеином антитела к полисахариду и тем самым выявить клетки, которые специфически связали антиген. Название метода обусловлено тем, что молекулы антигена располагаются между антителами, образованными в клетках, и теми, которые добавлены в качестве второго слоя.