Прямой твердофазный ИФА.

Рис. 22 .Схема выявления Аг методом прямого и конкурентного твердофазного ИФА.

Классические методы выявления бактериальных Аг — реакции агглютинации, преципитации и гемолиз сенсибилизированных эритроцитов для экспресс -диагностики инфекций применяют достаточно редко, т.к. они требуют наличия значительной концентрации Аг в образцах, что нетипично для ранних этапов заболевания. Однако их широко использую серотипирования возбудителей, а также при проведении полного объёма бактериологических исследований. Наибольшее распространение нашла реакция агглютинации (точнее иммуноагглютинации) с коммерческими антисыворотками. Пожалуй, единственной реакцией преципитации для экспресс -диагностики бактериальных Аг остаётся реакция Асколи.

рис. 23. Принципиальные схемы реакций антисывороток с исследуемым Аг.

ИНДИКАЦИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

Одновременно с выделением и изучением основных возбудителей инфекций человека интенсивно развивались серологические методы их диагностики; принципы основных серологических реакций были заложены исследованиями антимикробных факторов сыворотки крови бактериолизинов. Эти методы обнаруживают специфические АТ; большая часть приемлема для идентификации Аг возбудителя; они остаются, единственным методом диагностики при невозможности или трудностях выделения возбудителя, сравнительно редко дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Все серологические реакции разделяют на простые и сложные.

А. Простые реакции. Обычно реагируют 2 компонента — Аг и АТ. К простым реакция относят реакции

▲агглютинации (РА), разделяемые на РА с неадсорбированным Аг и РА с Аг адсорбированным на корпускулярных носителях (эритроцитах, бактериях, нерастворимы) красителях, бентонитах). Механизм РА описывает теория решётки, согласно которой двухвалентное АТ взаимодействует одним активным центром с детерминантой одной а другим — с детерминантой второго Аг. В результате подобного взаимодействия образуется агглютинат. Его образование невозможно при дефиците или избытке АТ. Визуально реакция проявляется склеиванием корпускулярных Аг АТ(агглютининами) и реализуется в изотоническом растворе.

Рис 24. Принципиальные схемы реакций агглютинации, связывания комплемента и нейтрализации.

Реакция адсорбции агглютининов. Если различные бактерии по систематическому положению имеют одинаковые или похожие по структуре Аг, то их агглютинируют одни и те же сыворотки. Для облегчения их идентификации используется реакция адсорбции агглютининов, основанная на способности Аг родственных бактерий адсорбировать из сыворотки только групповые АТ, сохраняя в ней типоспецифические АТ. Полученные антисыворотки называют монорецепторными, т.к. они содержат АТ только к одному Аг. Для сорбции агглютининов применяют взвесь убитых бактерий; если они убиты нагрев­нием, то адсорбируются О-агглютинины, если формалином, то Н-агглютинины.

Непрямые реакции. Методы, использующие иммунологически инертные частицы (адсорбенты), обработанные Аг, называют непрямыми, или пассивными, реакциями. Исходным является разведение сыворотки 1:20. В качестве Аг используют живые и убитые бактерии в физиологическом растворе. Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РИГА, РПГА) основана на способности АТ взаимодействовать с Аг, фиксированными на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. Разновидность метода — реакция латекс-агглютинации. В некоторых случаях на частицах фиксируется не Аг, а АТ (обратная РПГА). Реакция торможенияпассивной гемагглютинации (РТПГА) является дальнейшим развитием РИГА и в некоторым смысле контролирует её специфичность. В отличие от РИГА, включает 3 компонента: Аг, АТ и АТ (Аг), адсорбированные на эритроцитах.

▲ реакции преципитаци (в жидкостях и гелях), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и опсоно-фагоцитарные реакции. Реакции преципитации (РП) основаны на феномене образования видимого осадка реципитата после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с АТ. РП позволяют выявлять незначительные количества Аг. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси Аг. Метод имеет много разновидностей.

Реакция кольцепреципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую Аг, и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Реакция микропреципитации (по Уаньё) применяется для нефелометрического вления АТ в небольших образцах сыворотки.

▲ косвенные (трёхкомпонентные) реакции, в состав которых входят реагирующие системы (животные, эритроциты и т.д.), например реакции нейтрализации (РН) возбудителя, реакции нейтрализации Аг (токсины, метаболиты) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА).Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности АТ связывать различые возбудители или их метаболиты, лишая их возможности реализовать свои биологические свойства (т.е. нейтрализовать их). Известны РН вирусов, токсинов и др. В определённой степени к ним относятся и реакции иммобилизации. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)основана на способности антисывороток ингибировать вирусиндуцированную гемагглютинацию. АТ связывают различи вирусы, лишая их возможности агглютинировать эритроциты. РТГА применяют в диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентг фикации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Б. Сложные реакции включают в себя несколько простых; к ним относят реакции связывания комплемента (РСК), реакции подавления связывания комплемента и реакции активации Аг из нейтральной смеси.

1. Реакция связывания комплемента. Наибольшее распространение нашла РСК, её применяют при диагностике различных бактериальных и вирусных инфекций. Основными факторами, лимитирующими более широкое применение РСК, являются её сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов [их необходимо го прямо перед постановкой реакции (комплемент), либо за несколько суток (эритроциты барана)] и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Во избежании артефактов приходится предварительно титровать рабочие дозы ингредиентов.

2. Реакция иммунного гемолиза. Нередко активация системы комплемента комплексом Аг-АТ визуально не проявляется, и для её выявления в качестве индикаторной системы используют реакцию иммунного гемолиза. Для этого в реакционную смесь вносят гемолитическую систему — эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической кроличьей антисывороткой. При наличии свободного комплемента (т.е. при отсутствии связывающего комплекса Аг -АТ) наблюдают гемолиз эритроцитов и реакцию считают отрицательной, если все молекулы комплемента связываются с иммунными комплексами, то разрушения эритроцитов не наблюдают и реакцию считают положительной.