Учет различных групп микроорганизмов

На плотных средах учет ведут на 1 г абсолютно сухой почвы. После инкубации чашки с засеянными средами вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний, которое отражает число живых клеток в почве. Одновременно после сушки бюксов с навесками почвы при температуре 105⁰ до постоянной массы определяют содержание сухой почвы в 1 г сырой.

При подсчете колоний на плотных питательных средах (МПА, КАА) закрытые чашки Петри просматривают в проходящем свете и с внешней стороны дна отмечают колонии чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкие колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Желательно для подсчета использовать специальный прибор с арифмометром. Если на чашке больше 200 колоний, их следует подсчитывать с камерой Вольфюгеля. Далее находят содержание клеток в 1 мл соответствующего разведения, умножив число колоний на 20 (так как было посеяно 0,05 мл), а чтобы определить количество клеток микроорганизмов в 1 г сырой почвы, полученное число клеток в 1 мл умножают на степень разведения (10^-3, 10^-4, 10^-5 и т. д.).

Для учета зародышей в 1 г абсолютно сухой почвы число клеток в 1 г сырой почвы делят на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример. Установлено, что при поверхностном посеве почвенной суспензии из разведения 10^-3 число колоний на чашке равно 52; влажность почвы 25% (при такой влажности 1 г сырой почвы содержит 0,75 г абсолютно сухой почвы). Число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы

Х = (52*20*1000)/0,75= 1386666.

При глубинном посеве число колоний в 1 г абсолютно сухой почвы подсчитывают таким же образом, но не умножают на 20, так как при высеве используют 1 мл суспензии.

Учет микроорганизмов на МПА проводят визуально на четвертый день после посева. При наличии колоний Вас. mycoides количество их учитывают на второй или третий день. После подсчета всех колоний на чашке их группируют по культуральным признакам (характер роста на агаре, цвет, края, поверхность и консистенция колонии) для качественной оценки сапрофитной микрофлоры на МПА. Обычно выделяют из общего количества микроорганизмов, развивающихся на МПА, следующие группы:

1) бациллы (видовой состав определяют по культуральным признакам);

2) неспоровые желтопигментные бактерии (колонии плоские, желто-оранжевые, а в проходящем свете прозрачные);

3) неспороносные флуоресцирующие бактерии (колонии плоские, прозрачные, выделяют в субстрат зеленый пигмент);

4) микобактерии (колонии мелкие, куполообразные, чаще розового и белого цвета), палочки изогнутые, ветвистые;

5) актиномицеты (колонии плотные, бесцветные или пигментированные, срастающиеся с агаром). Воздушный мицелий на МПА образуют редко.

Учет микрофлоры на крахмало-аммиачном агаре.Колонии на таком агаре подсчитывают на 7-10-й день. Из общего количества колоний отдельно учитывают:

1) пигментные - желтые и другие микобактерии, образующие куполообразные колонии;

2) актиномицеты (из них можно выделить актиномицеты с серым, зеленовато-серым, розовым и белым воздушным мицелием).

Учет на среде Эшби. Его проводят на 5-6-е сут. Отдельно подсчитывают колонии азотобактера - плоские, слизистые, мажущейся консистенции диаметром 5-10 мм и олигонитрофильные бактерии, образующие мелкие, слизистые, прозрачные, бесцветные колонии.

Учет микроорганизмов на жидких средах. При определении численности микроорганизмов на жидких средах крестом отмечают пробирки, в которых наблюдается развитие микроорганизмов. Для более точного подсчета используют таблицу Мак-Креди, составленную на основании и обработки многочисленных результатов методом вариационной статистики. При расчете необходимо составить числовую характеристику из трех цифр.

Первая цифра числовой характеристики отражает число параллельно засеянных пробирок: в представленном ниже примере это будет цифра 4 из разведения 10^-3. Следующая за ней цифра (в данном случае 2) обозначает число пробирок, где еще происходит развитие микроорганизмов в последующих разведениях (эта цифра всегда будет меньше, чем число засеянных пробирок). И последняя цифра - может быть 1 (как в нашем случае), 0 или 2 - отражает число пробирок с развившимися клетками микроорганизмов, но не во всех повторностях.

Ниже приведен пример оформления результатов для учета численности микроорганизмов по таблице Мак-Креди.

Числовая характеристика в рассматриваемом примере равна 421 (подчеркнуто). По таблице Мак-Креди находим наиболее вероятное число клеток микроорганизмов, соответствующее данной числовой характеристике. Оно равно 9,5 и соответствует числу микроорганизмов, содержащихся в 0,001 г почвы (поскольку вероятное число всегда определяется для того разведения, где во всех пробирках, параллельно засеянным, наблюдался рост микроорганизмов, а это было разведение 10^-3). Для учета микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы полученное число делят на количество этой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы, учитывая ее влажность. При влажности почвы 25% абсолютной сухой почвы в 1 г сырой почвы будет 0,75 г. Найденное число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы будет равно

(9,5*1000)/0,75=12666.

Наличие денитрифицирующих бактерий и анаэробных азотфиксаторов (Clostridium pasteurianum) устанавливают на 5-6-е сутки инкубации по присутствию газов в поплавках.

При развитии микроорганизмов, образующих газы, последние вытесняют жидкость из поплавка.

Наличие аэробных целлюлоозоразрушающих микроорганизмов определяют между жидкой средой и воздухом на 8-10-й день инкубации по образованию колоний и разрушению клетчатки на границе между жидкой средой и воздухом.

Учет аэробных азотфиксирующих бактерий методом обрастания комочков почвы. На 5-7 -е сутки подсчитывают комочки, обросшие колониями азотобактера, а затем определяют, какой процент они составляют от общего числа комочков почвы (относительная оценка плотности населения учитываемой группы бактерий в почве).

Если комочки обрастают колониями Azotobacter сhrососсum, то колонии со временем приобретают буро-черную окраску. А. agi1e и А. vinelandii образуют колонии, которые обладают заметной флуоресценцией. У А. leijerinckii колонии слизистые, бесцветные (этот вид распространен в тропических почвах - красноземах). При анализе опыта знакомятся с возбудителями аэробной азотфиксации, для чего из колоний готовят окрашенные препараты и просматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа. Клетки азотобактера могут иметь палочковидную овальную форму, часто встречаются диплококки (крупные округлые клетки, располагающиеся попарно).