Молекулярно-цитогенетические методы

На основе методов молекулярного анализа нуклеиновых кислот была разработана серия новых техник изучения интерфазных хромосом, характеризующихся высокой специфичностью и точностью - методы гибридизации in situ (FISH, CGH, SKY).

Метод FISH- флуоресцентная гибридизация in situ - включает следующие этапы:

- создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин; зонды могут быть комплементарны хромосоме или ее конкретному участку;

- щелочная обработка препаратов in situ с целью денатурации хромосомной ДНК за счет разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК;

- гибридизация хромосомной ДНК сзондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы;

- обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином (и дигоксегенином; для биотина таким веществом является стрептовидин, для

дигоксегенина - антидигоксигениновое антитело; к этим веществам могут быть присоединены флуоресцентные красители (родамин или флуоресцеинт изотиоцианат);

- визуализация хромосом спомощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.

Метод FISH используется для выявления:

- численных хромосомных аномалий в интерфазном ядре;

- структурных аномалий;

- сложных межхромосомных перестроек;

- учета симметричных аберраций у облученных лиц;

- локализации гена.

Этот достаточно простой, точный, быстрый и экономичный метод находит все более широкое применение в диагностике врожденных аномалий, моногенных синдромов, в том числе, в пренатальной диагностике.

CGH - метод сравнительной геномной гибридизации,используется в онкологической цитогенетике для выявления делетированных (выпавших) или амплифицированных участков хромосом при некоторых типах опухолей. Делетированные участки, как правило, содержат гены-фупрессоры опухолей, а амплифицированные участки - онкогены. Это позволяет использовать метод для картирования и клонирования генов, вовлеченных в канцерогенез.

Метод CGH заключается в следующем: ДНК, выделенную из опухоли и из нормальной ткани, метят разными флуорохромами. Меченую ДНК из опухоли и нормальной ткани гибридизуют с хромосомным препаратом, и по интенсивности свечения метки определяют участки, содержащие делеции и амплификации. Для обработки данных используют специальные программы компьютерного анализа.

SKY - спектроскопический анализ хромосом. Метод основан на использовании набора зондов и флуоресцентных красителей, имеющих сродство к определенным участкам хромосом. Каждая пара хромосом, таким образом, имеет уникальные спектральные характеристики. Используя интерферометр, аналог аппарата для измерения спектра астрономических объектов, можно определить незначительные вариации в спектральном составе хромосом, неразличимые человеческим глазом. Данные подвергаются компьютерной обработке по специальной программе, в результате чего каждая пара хромосом приобретает определенный цвет. Преимущество метода состоит в более точной идентификации гомологичных хромосом, которые имеют один и тот же цвет, и возможности выявления некоторых транслокаций, которые другими цитогенетическими методами не определяются. Метод используется в онкоцитогенетике для выявления в кариотипе опухолевых клеток даже очень незначительных по величине хромосомных аберраций.