Методические указания

1. Разбор основных правил отбора и подготовки проб молока

и молочных продуктов к анализу

Пробы для микробиологических анализов молока и молочных продуктов отбирают до взятия образцов для изучения физико-химических и органолептических признаков. Пробы жидких и полужидких продуктов отбирают после тщательного перемешивания стерильным черпаком и переносят около 50-60 см³ в стерильную посуду. От молока, расфасованного в бутылки, пакеты, кисломолочных продуктов отбирают по 2 образца (количество образцов в выборке может достигать 4-5 в зависимости от величины партии). Пробы сливочного масла, творога, сыра отбирают с помощью профламбированного щупа из разных мест тары. Поверхность сыра в том месте, где будет взята проба, прижигают раскалённым ножом или шпателем. Отобранные точечные пробы переносят в посуду и тщательно перемешивают, составляя объединённую пробу, предназначенную для анализа: молоко - 1 л; масло, сыры - в среднем 100-150 г. Молочные консервы отбирают по 2 банки от партии. Сухое молоко, сухие сливки отбирают из разных мест с помощью стерильной ложки - всего около 200 г продукта.

Все отобранные пробы помещают в стерильные банки или бутыл­ки с хорошо закрывающимися крышками. Пробы пломбируют или опечатывают и немедленно отсылают в лабораторию. Разрешённое время транспортировки скоропортящихся продуктов до начала иссле­дования (при температуре не выше 6 °С) составляет не более 4 ч.

При подготовке проб к исследованию молоко и сливки тщательно перемешивают. Из твёрдых продук­тов (сыр, творог) готовят навеску 10 г. Затем продукт тщательно растирают и изготавливают 10% взвесь в 0,9% растворе натрия хлорида (90 см³). Масло и мороженое предварительно растапливают на водя­ной бане при температуре 30±2 °С. Для приготовления разведений используют нижний слой получившейся суспензии.

2. Метод определения уровня бактериальной обсемененности

сырого молока - редуктазная проба

В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.

Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсеменённость сырого молока.

Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения.

В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого сырого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37±1) °С. При отсутствии редуктазника допускается использовать водяную баню, обеспечивающую поддержание температуры (37±1) °С. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с сырым молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше, температуру (37±1) °С поддерживают в течение всего времени определения. Пробирки с сырым молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой). Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 1 ч. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из классов в соответствии с таблицей 1. Цветовая шкала для определения класса сырого молока по редуктазной пробе с резазурином представлена в приложении к занятию.

Таблица 1.Оценка редуктазной пробы

3. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2.Стандартные разведения молочных продуктов для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэроб­ных микроорганизмов

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает от 15 до 300 колоний.

Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см³ в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14±1) см³ расплавленной и охлажденной до температуры 40 °С - 45 °С питательной средой для определения КМАФАнМ. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и тоже же разведения в количестве 1,0 и 0,1 см³. Сразу после заливки среды содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. Допускается проведение двух параллельных определений, то есть проведение посева каждого разведения на две чашки Петри. После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат при температуре (30±1) °С на 72 ч.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки. При подсчете колоний рекомендуется использовать счетчики.

При большом количестве колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают количество колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднеарифметическое значение количества колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом, находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 см³ или 1 г продукта каждой чашке Петри вычисляют по формуле:

X=n ×10^m,

где n - количество сосчитанных колоний; m - число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое, полученное по всем чашкам.

4. Метод определения БГКП по признакам роста

на жидкой среде Кесслер

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу с образованием газа и кислоты при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. Признак роста БГКП на жидкой среде Кесслер - визуально наблюдаемое накопление газа в поплавке.

Посев продуктов или их разведений в жидкую среду Кесслер проводят в количествах, указанных в таблице 3.

Таблица 3.Количество продукта при посеве в среду Кесслер для выделения бактерий группы кишечной палочки

По 1 см³ соответствующих разведений продукта засевают в пробирку с 5 см³ жидкой среды Кесслер. Каждое разведение засевается в одну пробирку со средой.

Посев 10 см³ пастеризованного молока, отобранного после пастеризатора, 10 см³ закваски на чистых культурах, 3 см³ кефирной закваски, 10 см³ замороженного бактериального концентрата или 10 см³ разведения 1:10 сгущенных молочных продуктов с сахаром проводят в колбы с 40-50 см³ жидкой среды Кесслер.

Пробирки или колбы с посевами помещают в термостат при (37±1) °С на 18-24 ч. Окончательный результат снимают через 24 ч для всех продуктов, кроме мороженого. Для мороженого продолжительность культивирования посевов - 48 ч.

При снятии результатов пробирки или колбы с посевами просматривают и визуально определяют наличие или отсутствие газа в поплавках. При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в данном объеме продукта. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии БГКП в нем.

5. Микроскопический метод исследований микрофлоры молока

и молочных продуктов

В молочной промышленности микроскопические исследования проводят при изучении микроморфологических особенностей микрофлоры молока, лабораторных и производственных заквасок, продуктов переработки молока.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода - не менее 10⁵ клеток в 1 см³ или 1 г исследуемого продукта.

Для приготовления препарата жидкого продукта на чистое предметное стекло наносят петлей каплю продукта и распределяют на площади 1-2 см².

Для приготовления препарата из творога, творожных продуктов, творожных сырков, сырных и альбуминных паст на стекло наносят каплю воды, вводят в нее петлей исследуемый материал, тщательно перемешивают и растирают на площади 1-2 см².

Для приготовления препарата из твердых продуктов - сыр, сырные продукты и т.д. их тщательно растирают со стерильной водой в стерильной ступке. Затем полученную массу петлей наносят на чистое предметное стекло и распределяют на площади 1-2 см².

При исследовании колоний микроорганизмов, выросших на твердых питательных средах (агаровая культура), часть колонии отбирают с помощью бактериологической петли или иглы и тщательно растирают в капле воды на предметном стекле.

Приготовленные микропрепараты высушивают при комнатной температуре на воздухе. Мазки фикси­руют и окрашивают 10% метиленовым раствором или по Граму. Кисломолочные продукты имеют свою специфическую микрофлору (табл. 4).

Таблица 4. Характеристика микрофлоры кисломолочных продуктов

6. Методы определения Staphylococcus aureus

6.1. Метод определения количества Staphylococcus aureus

с предварительным обогащением

Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений.Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см³ в пробирки или колбочки с солевым бульоном. Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10. Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар. Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.

После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний. На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды. На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых. На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1-3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Посевы выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч.

У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus колоний, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

Далее ставят реакцию плазмокоагуляции.

В пробирку с 0,5 см³ разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37±1) °С в течение 3-6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом. При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2. Метод определения количества Staphylococcus aureus

без предварительного обогащения

1 см³ жидкого продукта или его разведения наносят на поверхность питательных сред Байрд-Паркера, желточно-солевой агар и молочно-солевой агар в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри. С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти - все колонии характерные для Staphylococcus aureus и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Если при изучении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к Staphylococcus aureus. В остальных случаях количество Staphylococcus aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см³ после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле:

где Σn₁; Σn₂- количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n - число десятикратных разведений.

7. Метод определения дрожжей и плесневых грибов