Методические указания

1. Разбор основных правил отбора проб для санитарно-микробиологического исследования консервов

Первоначально проверяют состояние тары и отмечают её недостатки - неисправность, отсутствие пломб, наличие плесени, загрязнённости, утечки, отсутствие или неясность маркировки.

Затем устанавливают однородность партии (продукт одного вида и сорта, в таре одного типа и размера, одной даты выработки, изготовленный одним заводом). Все организации, занятые хранением и реализацией консервной продукции, при приёме, хранении и выпуске на довольствие консервов обязаны их сортировать, отбраковывать банки с подтёками, бомбажные, пробитые гвоздями и сильно деформированные.

На каждую выявленную партию непригодных в пищу консервов состав­ляют акт с указанием причин браковки, количества забракованных банок, маркировки. Такие консервы хранят до утилизации или уничтожения в отдельных помещениях на особом учёте.

При пищевых отравлениях консервами отбор проб для анализа проводят в таком количестве, какое необходимо по заключению санитарно-эпидемиологической службы или какое удаётся собрать, включая и недоеденные остатки. В этих случаях отобранные пробы помещают в стерильную посуду вместе с банками и опечатывают или пломбируют.

От партии отбирают исходный образец, из которого формируют среднюю пробу. От пищевых консервированных продуктов, расфасованных в жестяную, стеклянную или полимерную тару вместимостью до 1 дм³, средний образец состоит из трёх единиц упаковки, а вместимостью от 1 до 3 дм³ - из одной упаковки. Если масса (объём) пробы продукта не уста­новлена в нормативно-технической документации на конкретный вид продукции в потребительской таре, то от каждой упаковочной единицы (коробка, ящик), попавшей в выборку, отбирают не менее одной банки.

При отборе проб консервов в жестяной таре необходимо руководс­твоваться действующими требованиями к маркировке указанного вида пищевой продукции. Маркировку условными обозначениями в три ряда по шесть знаков на банки наносят методом выштамповывания или несмываемой краской на внешней стороне дна или крышки банки.

Отобранные единицы расфасовки осматривают. Отмечают наличие и состояние бумажной этикетки или литографического оттиска, также дефекты тары: нарушение герметичности, потёки, вздутие крышек и донышек, хлопающие крышки и др. Обязательно указывают на деформацию корпуса и донышек жестяных банок, ржавые пятна, степень их распространения, дефекты продольного и закаточного швов. Результаты наблюдения протоколируют.

Для проверки герметичности тары банки укладывают в сосуд
нагретой до кипения водой (но не ниже 80 °С) на 5 мин при высоте
слоя воды над банками не менее 5 см. Над поверхностью разгерметизированных банок появляются пузырьки воздуха.

2. Метод определения доброкачественности консервов

(термостатная выдержка)

Термостатная выдержка - эффективный способ контроля доброкачественности консервов. Перед микробиологическим анализом консервы выдерживают в термостате до 5-7 сут при температуре 37 °С. Рыбные консервы в масле (шпроты, треска, корюшка и др.) не подлежат термостатной выдержке вследствие возможной активизации стафилококков, которые иногда сохраняются при термической обработке из-за низкой теплопроводности масла. Известно, что развитие стафилококков не сопровождается газообразованием, поэтому банки выглядят не вздутыми.

Не подвергают термостатной выдержке фруктовые компоты, пюре
и соки, томатные и соевые соусы, цельноконсервированные томаты, огурцы и другие консервы, имеющие кислую реакцию, так как кислая среда препятствует токсинообразованию микроорганизмов - возбу­дителей пищевых отравлений (С. botulinum, Staphylococcus spp).

Термостатному контролю не подлежат пресервы, т.е. заведомо несте­рильные продукты, например, кильки, маринованные грибы, овощи ифрукты, сгущённое молоко с сахаром, варенье, джемы, повидло и др.

Консервы вскрывают после нахождения в термостате (бомбажные банки подобной подготовке не подвергают). Непосредственно перед вскрытием консервируемый продукт перемешивают десятикратным переворачиванием с донышка на крышку.

Перед вскрытием банки тщательно протирают спиртом. Затем берут один из заранее приготовленных стерильных ватных тампонов, смачива­ют его спиртом, поджигают в пламени горелки и помещают на крышку банки. Сквозь пламя или под горящий тампон подводят предварительно обожжённый пробойник и прокалывают крышку. Отверстие должно быть около 1-1,5 см в диаметре. Если консервы не содержат жидкой фазы, то делают подряд три-четыре прокола так, чтобы длина отверстия была не менее 3 см.

Лабораторный контроль консервов, выпущенных для реализации и хранения на складах, проводят:

· когда внешний вид партии вызывает подозрения (повышенное количество бомбажных, деформированных, разгерметизирован­ных банок и др.);

· по прямым эпидемиологическим показаниям (пищевые отрав­ления данными консервами);

· в ряде других случаев.

Консервы исследуют на промышленную стерильность, для выяв­ления возбудителей порчи и патогенной (токсигенной) флоры.

3. Методы санитарно-микробиологического исследования консервов

3.1. Определение МАМ и ФАнМ

Для выявления МАМ и ФАнМ в две пробирки (по 5 см³) мясопептонного бульона с глюкозой вносят стерильной трубкой по 1 см³ пробы консервированного продукта. Посевы выдерживают при температуре 37 °С в течение 5 сут. Посевы для выявления термофильных микроор­ганизмов инкубируют при температуре 55-62 °С. За признаками роста наблюдают ежедневно. При появлении помутнения, образовании плёнки, выделении пузырьков газа содержимое пробирок микроскопируют и делают пересев в случае необходимости.

Мезофильные бациллы из группы В. subtilis (В. subtilis, В. pumilus, В. licheniformis) в посевах не выделяют газа, имеют форму палочек со спорами, положительно или вариабельно окрашиваются по Граму и синтезируют каталазу. Факультативно-анаэробные газообразующие бациллы из группы В. polymyxa (В. polymyxa, В. macerans, В. circulans) могут не синтезировать каталазу.

При отрицательных результатах тестов на МАМ и ФАнМ в посевах делают вывод об отсутствии активно развивающихся микроорганизмов этой группы.

Обнаружение в посевах признаков роста микроорганизмов, отличных
от таковых у бактерий группы В. subtilis, указывает на присутствие другой
микрофлоры. В таком случае отмечают характер роста на питательной среде, морфологию клеток (кокки, грамотрицательные палочки, грамположительные неспорообразующие палочки), отношение к каталазе.

3.2. Методы выявления мезофильных анаэробных микроорганизмов

Для обнаружения мезофильных анаэробных микроорганизмов проводят посев по 2 см³ консервированного продукта в две пробир­ки, содержащие 12 см³ регенерированной среды Китт-Тароцци. Если среда не содержит агар, сразу после посева наслаивают на поверхность голодный агар или вазелиновое стерильное масло в таком количестве чтобы образовался слой высотой 1 см. Посевы держат в термостате при температуре 37 °С в течение 5 сут.

Развитие мезофильных анаэробных микроорганизмов в посевах сопровождается помутнением среды, выделением газа, появлением постороннего запаха, в некоторых случаях разложением кусочков мяса или печени. Материал для приготовления препаратов для микроскопии берут пастеровской пипеткой со дна пробирки.

В мазках с облигатно-анаэробными бактериями видны палочки, окрашивающиеся положительно по Граму и образующие споры. Если, каталаза не выявлена, то анализ прекращают и считают, что в посевах присутствуют мезофильные анаэробы.

Если при микроскопии спорообразующие микроорганизмы не обна­ружены, то отрицательная проба на каталазу не считается достаточной для прекращения исследования. В случае выявления смешанной мик­рофлоры и наличия положительной пробы на каталазу исследование продолжают. Посевы в чашках (1-2 капли) заливают растопленным и охлаждённым до температуры 45 °С МПА с глюкозой и среду тщательно перемешивают. На застывшую поверхность агара накладывают стериль­ное предметное стекло так, чтобы под стеклом не было пузырьков возду­ха. Чашку помещают в термостат при температуре 37 °С на 24-48 ч. При обнаружении под стеклом роста бактерий или разрывов в агаре считают, что в посеве присутствуют мезофильные анаэробные микроорганизмы.

Посевы в чашках можно заливать средой Вильсона-Блер, расплав­ленной и охлаждённой до 45 °С. Посевной материал и среду переме­шивают. Застывшую поверхность заливают холодным агаром. Посевы помещают в термостат на 24-48 ч (температура 37 °С). Появление в агаре чёрных или коричневых колоний свидетельствует о присутствии на посевах гнилостных и протеолитических микробов.

Для подтверждения присутствия бацилл в споровой форме навески консервированного продукта дополнительно вносят в две пробирки со средами, одну из которых прогревают на водяной бане в течение 30 мин при температуре 80±1 °С (для выявления спор мезофильных микроорга­низмов), другую - при температуре 95±1 °С (для термофильных видов).

3.3. Метод определения Bacillus cereus

Для проведения испытания отбирают объем 0,1-0,2 см³ подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости. Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей на поверхность питательной среды. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают поверхностным методом параллельно в две чашки Петри с предварительно подсушенной селективной средой (агар желточный с маннитом, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и феноловым красным или лецитин-агар для выделения В. cereus из консервированных продуктов). Посевы на чашках Петри термостатируют при (30±1) °С в течение 24-48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и выбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для В. cereus. На лецитин-агаре колонии диаметром 1,5-2,0 мм, окруженные зонами преципитата синего цвета диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые; затем края колоний становятся изрезанными. На желточном агаре с маннитом – колонии розовые (вследствие отсутствия способности ферментировать маннит), крупные, шероховатые, сухие, окруженные зоной бело-розового преципитата.

Для подтверждения принадлежности подсчитанных колоний к колониям, образуемым В. cereus, микроорганизмы из пяти колоний пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и термостатируют 18-24 ч при (30±1) °С. На скошенном мясо-пептонном агаре В. cereus образует сплошной налет белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью. Со скошенного мясо-пептонного агара готовят препараты, окрашивают по Граму, а также определяют подвижность клеток при микроскопировании методом висячей капли.
В мазках, приготовленных со скошенного агара, В. cereus имеет вид крупных грамположительных палочек размером 1,0-1,2x3,0-5,0 мкм со слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже отдельно друг от друга. В. cereus образует субтерминальные или центральные споры. В висячей капле клетки подвижны, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной подвижностью.

Для полного подтверждения проводят биохимические тесты (способность образовывать ацетилметилкарбинол, ферментировать в анаэробных условиях глюкозу и не ферментировать маннит). Результаты испытания продукта оценивают по каждой пробе отдельно.

3.4. Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum

3.4.1. Подготовка продукта к испытанию

Для выявления ботулинических токсинов отбирают 100 см³/г жидкого продукта, культуральной жидкости анаэробных посевов, жидкую фракцию продуктов смешанного состава, водные экстракты или экстракты, приготовленные с физиологическим раствором пастообразных, сыпучих продуктов и продуктов твердой консистенции. Объем приготовленной исходной жидкости должен составлять около 30 см³. Полученные смеси выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 2 ч и затем извлекают из них жидкую фракцию. Жидкую фракцию отделяют от продукта отстаиванием и (или) фильтруют через ватно-марлевый или другой фильтр, не адсорбирующий ботулинические токсины, или центрифугируют при температуре (4±2) °С и частоте вращения 500 с^-1 в течение 1-2 мин. Подготовленную таким образом исходную жидкость переносят в стерильную колбу; хранят при температуре (4±2) °С не более 7 сут.

Для выявления и выделения С. botulinum отбирают 100 см³/г продукта из различных мест, имеющих и не имеющих изменения; гомогенизируют или доводят до однородной консистенции. Допускается для посева использовать продукт, оставшийся после отделения или экстрагирования из него жидкой фазы. Для выявления в любых продуктах вегетативных клеток и спор С. botulinum приготавливают не менее четырех навесок массой 20,0-25,0 г (см³) любого продукта.

3.4.2. Выявление С. botulinum

Для выявления С. botulinum навески продукта вносят на дно сосуда с питательной средой (печеночно-глицериновый агар, Китта-Тароцци). Одну из навесок обрабатывают перед посевом этиловым спиртом (96% или абсолютным). Навеску смешивают с равным объемом спирта в колбе с притертой пробкой и, периодически встряхивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Навеску или осадок навески, обработанные спиртом, вносят в питательную среду. Посевы термостатируют, наблюдая за появлением признаков роста микроорганизмов до 14 сут. После появления признаков роста микроорганизмов посевы продолжают выдерживать в термостате 5 сут. Через 5 сут после появления роста микроорганизмов посевы переносят в холодильник и хранят при (4±2) °С.

Развитие С. botulinum в питательных средах начинается со дна пробирки, с помутнения среды, которое равномерно распространяется по всему столбику жидкости, иногда отступая от поверхности на 0,5-1,0 см, и сопровождается выделением пузырьков газа. Видимое газообразование может отсутствовать. Культуральная жидкость издает посторонний запах: гнилостный, сырный, масляно-кислый - от слабо выраженного до явного. С возрастом клетки С.botulinum частично лизируются, часто оседают на дно, и помутнение среды исчезает.

Непосредственно после появления признаков роста микроорганизмов и затем на 3-и и 5-е сут из посевов отбирают пастеровской пипеткой со дна культуральную жидкость для окраски по Граму, окраски спор, фазово-контрастного микроскопирования и пробы на каталаз. В препаратах устанавливают морфологию бактерий, отмечают наличие типичных клостридиальных клеток, наличие и относительную интенсивность спорообразования и место локализации спор внутри клеток. За 18-24 ч культура С. botulinum образует грамположительные палочки с закругленными концами различной длины и ширины. При старении культуры в ней появляются клетки, не окрашивающиеся по Граму, и спорообразующие клетки обычно в виде ракеток и отдельные споры. Возбудители ботулизма в чистой культуре каталазу не образуют.

После появления признаков роста микроорганизмов пятидневную культуральную жидкость из всех посевов одновременно или последовательно исследуют на присутствие ботулинических токсинов и ботулинических протоксинов.

3.4.3. Выявление ботулинических токсинов

Выявление ботулинических токсинов проводят только по обнаружению ботулинического токсина и определению титра токсина в исходной жидкости или одновременно с использованием противоботулинических антитоксических сывороток. В первом случае для выявления ботулинических токсинов используют исходную жидкость. В две пробирки пипеткой с резиновой грушей переносят по 2-3 см³, а в третью - 2,7 см³исходной жидкости. В последнюю пробирку стерильной пипеткой добавляют 0,3 см³ раствора трипсина или панкреатина. В смеси исходной жидкости с ферментом с помощью раствора гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты устанавливают рН (6,0±1). Затем пробирку со смесью термостатируют при (37±1) °С в течение 1 ч, но не дольше, периодически перемешивая содержимое. Культуральную жидкость, полученную из посевов продуктов в питательную среду, содержащую трипсин или панкреатин, протеолитическим ферментом не обрабатывают. Вторую пробирку с исходной жидкостью кипятят на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Первую пробирку с исходной жидкостью оставляют без обработки.

Непосредственно после окончания обработки исходной жидкости протеолитическим ферментом ставят биологическую пробу на белых мышах. По 0,5-1,0 см³ подготовленной соответствующим образом исходной жидкости вводят в зависимости от условий опыта внутрибрюшинно не менее чем двум белым мышам. Животных осматривают через 1, 2, 4, 12 ч и далее не менее двух раз в день в течение 72 ч. Ботулинические токсины не вызывают молниеносной гибели животных; клинические симптомы ботулинической интоксикации животных токсином типа Е, как правило, появляются через 2-4 ч, токсином других типов - через 10-12 ч после инъекции. Высокие концентрации токсина могут вызвать гибель мышей в течение 1-2 ч без проявления клиники ботулизма. В этом случае ставят повторно биологическую пробу с исходной жидкостью, разведенной в 10-100 раз. Мыши болеют и погибают не раньше, чем через 2 ч после инъекции токсина, чаще всего в течение 4-6 ч. Клинические симптомы болезни и гибели мышей при ботулинической интоксикации очень характерны: шерсть взъерошивается, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают, давая симптом «осиная талия»; появляются судороги, паралич задних конечностей; гибель при явлениях полного паралича из-за остановки дыхания.

При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те животные, которым введена необработанная протеолитическим ферментом жидкость, и, если фермент не инактивировал ботулинический токсин, то болеют и погибают животные, которым введена жидкость, обработанная протеолитическим ферментом. При наличии в исходной жидкости ботулинических протоксинов болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации в первую очередь те животные, которым введена обработанная ферментом жидкость; мыши, которым введена не обработанная ферментом жидкость, могут переболеть, но не погибают или погибают позже.

3.4.4. Серологическое типирование токсина С. botulinum

(защитный тест)

Присутствие ботулинического токсина в исходной жидкости обнаруживают путем постановки биологической пробы на мышах, защищенных иммунизацией противоботулиническими антитоксическими сыворотками типов А, В, Е (и, если представляется возможным, типов С, D, F, G). Сыворотка типа С должна содержать антитоксины типов С₁ и С₂. Поливалентные сыворотки и типы поливалентных сывороток для опыта подбирают в зависимости от вида анализируемого продукта и предполагаемого типа ботулинического токсина в соответствии с определенными комбинациями и порядком.

При постановке защитного теста для типирования ботулинических токсинов каждому животному внутрибрюшинно вводят по 0,5 см³ моновалентной, двух-, трех- или поливалентной сыворотки. Для инъекции одного типа сыворотки или их смеси каждой группе животных применяют отдельный шприц. Через 60 мин после введения сывороток животным вводят исходную жидкость. Введение животным исходной жидкости начинают с наибольшего ее разведения, используя один шприц для группы мышей, получивших моновалентную сыворотку одного типа или двух-, трех- или поливалентную сыворотку, состоящую из одной комбинации моновалентных сывороток.

При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те мыши, которым введена сыворотка, не гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости. Погибают также мыши, которые получили гомологичную сыворотку в объеме, недостаточном для защиты от высокой дозы токсина. Мыши, получившие сыворотку, в состав которой входит моновалентная сыворотка, гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости, остаются живы. Если болеют и погибают все животные, то биологическую пробу повторяют, применяя более разбавленную исходную жидкость или ранее не использованные комбинации моновалентных сывороток.

Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина реакцией нейтрализации.

3.5. Метод определения Clostridium perfringens

Для проведения испытания отбирают объем (1±0,1) см³ подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают глубинным методом параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают сахарным кровяным агаром по Цейсслеру или агаром Вильсон-Блера. Содержимое чашек Петри быстро, осторожными круговыми движениями перемешивают. После застывания среды чашки подсушивают и заливают той же средой так, чтобы высота второго слоя питательной среды была не менее 4 мм. Посевы на чашках Петри термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 18-24 ч в анаэростатах или в анаэробных условиях. После окончания термостатирования отбирают те чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Подсчитывают количество выросших характерных колоний. Характеристика колоний С. perfringens на селективных питательных средах приведена в приложении. Далее проводят изучение морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для С. perfringens.

Контрольные вопросы

Какие основные группы консервов вы знаете?

Что такое полуконсервы и пресервы?

Как проводится отбор проб консервов?

Как устанавливается однородность партии консервов?

Как формируют среднюю пробу?

Как проверяют герметичность консервной тары?

Как определяют доброкачественность консервов?

Какие консервированные продукты не подвергают термостатной выдержке и почему?

В каких случаях проводится лабораторный контроль консервов, выпущенных для реализации и хранения на складах?

По каким микробиологическим показателям оцениваются консервы?

Как определяются МАМ и ФАнМ в консервах?

Какие существуют методы выявления мезофильных анаэробных микроорганизмов?

В чем сущность метода определения Bacillus cereus?

Как осуществляется подготовка продуктов при выявлении ботулотоксинов?

Какие среды используют для выявления Cl. botulinum?

Как выявляются ботулинические токсины в консервах?

Как проводится защитный тест при типировании ботулотоксинов?

Как определяется Cl. perfringens в консервах?

Как проводится микробиолоический контроль консервов в зависимости от их групповой принадлежности?

Что такое бомбаж консервных банок, какие причины его возникновения вы знаете?

Какие пищевые продукты чаще всего могут являться причиной возникновения ботулизма?

Какие характерные свойства ботулотоксина вы знаете?