Методические указания

1. Разбор основных правил отбора проб рыбы и рыбных продуктов

Отбор проб для исследования осуществляют по общим правилам (ГОСТ 26668-85).

Рыбу охлаждённую, мороженую, солёную, пряную, маринованную, вяленую, сушёную и копчёную; солёные балычные полуфабрикаты и балычные изделия берут в количестве нескольких экземпляров.

Для гигиенических исследований отбирают по 3 куска массой до 100 г каждый:

• рыбу жареную, отварную, печеную;

• рыбные рулеты, котлеты, сосиски, колбасы;

• фаршированную рыбу;

• студень, зельц;

• заливную рыбу;

• изделия из икры и др.

Для бактериологического исследования продукты берут с соблюде­нием правил асептики. Обеспечивают минимальные сроки доставки образцов в лабораторию, в жаркое время года продукты дополнительно охлаждают. В лаборатории навеску рыбы и рыбопродуктов плотной консистенции стерильно растирают в фарфоровой ступке, добавляя стерильную водопроводную или дистиллированную воду до конечной концентрации взвеси 10%.

Отбор средней пробы всех кулинарных изделий для микробио­логических исследований проводят с соблюдением правил асептики стерильным ножом, ложкой, скальпелем в стерильные банки общей массой не менее 300 г от трёх единиц (упаковок). Отбор проб взаливках осуществляют пропорционально соотношению входящих компонентов.

Поверхность оболочечных изделий протирают спиртом. Из трёх батонов фаршевых изделий, соблюдая правила асептики, вырезают поперечные куски, затем разрезают их продольно и вырезают кусочки из центральной части и из-под оболочки.

Замороженную рыбу, рыбо- и морепродукты размораживают при температуре 18-20 °С в течение 1-2 ч и затем отбирают пробу, как при исследовании незамороженных кулинарных изделий. Мелкую рыбу и мелкие нерыбные объекты морского промысла в количестве 3-10 шт. отбирают из разных мест обследуемой партии. Печёную рыбу исследуют целиком. Крупную рыбу или куски порционной рыбы и крупные экземпляры нерыбных объектов морского промысла отби­рают в количестве не менее 3 шт. Из разных мест каждого образца стерильным скальпелем вырезают по 2-3 кусочка площадью 4 см², толщиной 4-5 см и переносят во взвешенную стерильную колбу. Посуду с образцами взвешивают и по разности масс устанавливают массу отобранной пробы.

Отобранную среднюю пробу измельчают в асептических условиях, затем 100-150 г исследуемого материала растирают в стерильной фар­форовой ступке или измельчают в гомогенизаторах (размельчителях тканей) РТ-1. Готовят десятикратные разведения.

2. Определение качества рыбной продукции путем

исследования мазков-отпечатков

Исследование мазков-отпечатков проводят в том случае, если доброкачественность рыбного сырья вызывает сомнение. Для этого кожу рыбы посередине спины или ближе к голове освобождают от чешуи и прижигают раскаленным скальпелем, затем стерильным скальпелем вырезают кусочки мяса рыбы площадью около 1,5 см² и толщиной 1,5-2,0 мм. Кусочком мяса делают отпечаток на стерильном предметном стекле. Отпечаток мышечной ткани фиксируют, проводя 3 раза над пламенем горелки, окрашивают любым красителем и просматривают под микроскопом не менее 10 полей зрения (увеличение х900). В поле зрения микроскопа в мазке-отпечатке ткани рыбы, пригодной к употреблению, должно содержаться не более 10 клеток микроорганизмов (микро- и диплококков).

При стойкой повышенной обсемененности готовой продукции для выявления источника обсеменения проводят микробиологический анализ сырья.

3. Санитарно-микробиологическое исследование рыбы и

рыбных продуктов

3.1 Определение бактериальной обсеменённости (количества МАМ и ФАнМ) в 1 г продукта

Для определения бактериальной обсеменённости рекомендую следующие разведения взвесей продуктов:

· рыба жареная и печёная, фаршевые изделия, студень, рыба заливках, рыба холодного и горячего копчения - 10^-1 и 10^-2;

· рыба заливная пастообразная - 10^-2 и 10^-3.

Для проведения анализа 1 и 0,1 см³ приготовленной взвеси вносят в стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и охлаждённым до температуры 50 °С МПА. Взвесь осторожно смешивают с МПА и помещают в термостат при температуре 37 °С на 48 ч. Учёт результатов проводят по общей методике определения числа колоний мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микро­организмов, выросших на поверхности и в глубине плотных питательных сред (Занятие №6, раздел 3.2.).

3.2. Методы определения БГКП

БГКП определяют бродильным методом на среде Кесслер. При этом в питательную среду вносят разное количество исследуемого материала в зависимости от вида продукта.

Для посева 1 г (рыбы жареной, фарша, студня, рыбы в заливках, рыбы холодного копчения) используют 10 см³ исходного гомогенатаи 50 см³ среды Кесслер; для посева 0,1 г продукта (рыбы заливной) - 1 см³ исходного гомогената; при анализе 0,01 г продукта (пастообраз­ного) - 1 см³ из разведения 10^-2. Посевной материал в соответствующих разведениях вносят в пробирки со средой Кесслер с поплавками для обнаружения газообразования. При отсутствии газообразования через 18-24 ч инкубации продукт считают не загрязненным бактериями группы кишечных палочек. Из пробирок с забро­дившей средой (помутнение, наличие газа в поплавках) делают посевы на чашки со средой Эндо. Посевы выдерживают в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 18-24 ч. Из колоний, типичных для БГКП (красных, с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), готовят мазки и окрашивают их по Граму.

3.3. Методы выявления коагулазоположительных стафилококков

в 1 г продукта

Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus основаны на высеве навески или разведения продукта в среды обогащения - солевые бульоны с содержанием натрия хлорида 6,5-10%, а также сахарный бульон, с последующим инкубированием посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний и подтверждения по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus. Методика проведения описана в занятии №6, раздел 3.5.

3.4. Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов

Метод основан на выявлении в посевах исследуемого материала на элективных агаровых средах колоний, подозрительных на парагемолитические вибрионы, последующего выделения из них чистой культуры и идентификации ее по набору признаков, определяющих принадлежность к виду V. parahaemolyticus.

Из поступивших в лабораторию проб продуктов берут навеску 25 г, измельчают и гомогенизируют в размельчителе тканей (например, блендере, гомогенизаторе типа Stomacher со стерильными пакетами) или тщательно растирают в стерильной ступке с 2-3 г стерильного кварцевого песка.

При количественном определении парагемолитических вибрионов измельченную навеску переносят в стерильную колбу с 225 мл 0,1%-го раствора пептонной воды с 3% натрия хлорида, получая исходное разведение 1:10. Взвесь тщательно взбалтывают, не допуская намокания пробки, дают отстояться и из надосадочной жидкости готовят десятикратные разведения (1:100, 1:1000) путем последовательного переноса по 1,0 мл из предыдущего разведения в 9,0 мл разводящей жидкости, каждый раз меняя пипетку для смешивания и переноса взвеси. В качестве разводящей жидкости могут быть использованы 0,1%-й раствор пептона с 3% натрия хлорида или фосфатный буферный раствор. Готовят десятикратные разведения до 10^-3, а при расследовании вспышек пищевых токсикоинфекций (ПТИ) - до разведения 10^-7.

Для определения присутствия (отсутствия) парагемолитических вибрионов в исследуемой пробе всю гомогенизированную навеску в 25 г переносят в 125 мл жидкой среды обогащения - 1%-й пептонной воды с 3% натрия хлорида и ингибиторами роста сопутствующей микрофлоры или без них.

При количественном анализе из разведений пробы 1:10, 1:100 и 1:1000 высевают по 0,1 мл на 2 чашки с элективной агаровой средой, например: питательной средой элективно-дифференциальной для выделения холерного вибриона сухой - СЭДХ - ВФС 42-411 ВС-93, селективной средой для выделения патогенных вибрионов - TCBS или дифференциально-диагностический агар с пенициллином – ДДА. Посевной материал распределяют по поверхности агара и дают подсохнуть. Посевы помещают в термостат при (37±0,5) °С на 18-24 ч.

При качественном анализе посевы в накопительные среды инкубируют при (37±0,5) °С в течение 18-20 ч, после чего делают высев петлей с поверхностного слоя обогатительной среды на 1-2 чашки элективной среды для получения роста в виде изолированных колоний.

После инкубации изучают рост на элективных средах, отбирают подозрительные на парагемолитические вибрионы колонии. При количественном анализе для подсчета отбирают чашки с посевом двух последовательных разведений, где выросло не более 300 колоний. Необходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. С каждой из 4-х отобранных для подсчета чашек отсевают по 5 колоний. Парагемолитические вибрионы на элективной среде формируют колонии правильной округлой формы, плосковыпуклые, полупрозрачные в проходящем свете с влажной блестящей поверхностью размером 2-3 мм в диаметре, не отличающиеся по цвету от голубовато-зеленого цвета элективных сред (СЭДХ, TCBS, ДДА), т.к. вибрионы этого вида не ферментируют сахарозу, входящую в них. Подозрительные колонии отсевают на щелочной агар - питательную среду для выделения и культивирования холерного вибриона, сухую (ФС 42-213 ВС-88) и на одну из полиуглеводных сред Ресселя или Клиглера.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичным для парагемолитических вибрионов ростом. На среде Ресселя и Клиглера отмечают характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части агара.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, изучают на наличие цитохромоксидазы. Из оксидазопозитивных готовят мазки по Граму.

Для дальнейшей идентификации отбирают оксидазопозитивные грамотрицательные культуры с характерным ростом на полиуглеводных средах. Отобранные культуры изучают по набору признаков (подвижность, лизиндекарбоксилаза, аргининдигидролаза, индол, рост в средах с различными концентрациями натрия хлорида, ферментация/окисление глюкозы на среде Хью и Лейфсона, арабинозы, сахарозы, целлобиозы, салицина, реакция Фогес-Проскауэра).

Контрольные вопросы

Какие особенности отбора проб рыбы и рыбных продуктов?

Как отбирают пробы замороженной рыбы?

Как проводят исследование рыбных продуктов методом мазков-отпечатков?

Какие патогенные микроорганизмы наиболее часто загрязняют свежевыловленную рыбу?

Как определяют бактериальную обсемененность рыбных продуктов?

Какие особенности определения БГКП вы знаете?

Как выявляют коагулазоположительных стафилококков в рыбных продуктах?

Какие существуют методы выявления парагемолитических вибрионов?

Какие среды используют для культивирования вибрионов?

Какие особенности микробиоценоза рыбы и рыбных продуктов вы знаете?

Какие бактерии являются главными возбудителями порчи охлажденной рыбы?

Какие микроорганизмы могут выживать в соленой рыбе?

Какие эпидемиологические особенности парагемолитических вибрионов вы знаете?