Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (АТР и креатинфосфат)

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения: АТФ и креатинфосфат. Они обеспечивают мышцу по мере надобности большим количеством энергии. Основной путь образования АТФ в тканях – окислительное фосфорилирование в процессе тканевого дыхания. Креатинфосфат образуется при участии АТФ в состоянии покоя и служит резервом высокоэргического фосфата для синтеза АТФ из AДФ при активной мышечной работе.

Принцип метода. Метод определения макроэргических соединений в мышцах основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфатный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде (лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза даёт представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на долю макроэргических соединений мышечной ткани.

Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Цель работы: количественное определение макроэргических соединений в мышечной ткани (АТФ и креатинфосфат).

Оборудование: цилиндр (V = 10 мл) – 1 шт., ледяная и кипящая водяная бани; спектрофотометр, кюветы с длиной оптического пути 10 мм; стеклянная воронка для фильтрования – 1 шт.; бумажные фильтры «белая лента»; пробирки; стеклянная палочка – 1 шт.; весы – 1 шт. (точность – до 0,01 г); фарфоровая ступка с пестиком – 1 шт.; химический стакан (V = 50-100 мл) – 1 шт.; мерный цилиндр (V = 10-25 мл) – 1 шт.; мерные пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл – по 1 шт.; металлическая фольга (от шоколадной обёртки или в рулоне).

Реактивы: скелетные мышцы животного; 2,5% раствор ТХУ (трихлоруксусной кислоты), 1 М раствор НСl, 1 М раствор NaОН, 1% раствор молибдата аммония, 1% раствор аскорбиновой кислоты; песок кварцевый (для измельчения мышцы в ступке); лёд; 500 мл раствора, содержащего 2,6250 г фосфата натрия.

Ход работы. I. Приготовление экстракта.

1. 0,5 г мышечной ткани, взвешенной на весах (с точностью до 0,01 г), в течение 10-15 мин. растирают с 2 мл дистиллированной воды и кварцевым песком в ступке, охлаждаемой холодной водой со льдом (ледяная баня).

2. Мышечную кашицу помещают в стакан, стоящий на той же ледяной бане, и добавляют в неё 5 мл охлажденного 2,5% раствора ТХУ. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой для экстрагирования АТФ и креатинфосфата в течение 5 мин.

3. Экстракт фильтруют в мерную пробирку или цилиндр, стоящий на ледяной бане. Остаток мышечной кашицы в пробирке заливают 5-ью мл дистиллированной воды и продолжают экстракцию на холоде в течение 5 мин. Полученный экстракт фильтруют в ту же мерную пробирку (или цилиндр) и доводят общий объём до 10 мл дистиллированной водой.