Опыт 1. Выделение рибонуклеопротеидов (РНП) из дрожжей и качественное определение продуктов их гидролиза (белка, рибозы, пуриновых оснований и фосфорной кислоты).

Ход опыта.Выделение РНП из дрожжей.

Для получения рибонуклеопротеидов можно использовать пекарские прессованные дрожжи, но лучше взять пивные дрожжи, которые вначале длительно отмывают от сусла водопроводной водой, а затем отфильтровывают на бюхнеровской воронке.

2 г дрожжей смешивают в ступке с 2 мл воды, добавляют 1 г песка и тщательно растирают, приливая к растертой массе небольшими порциями 1-15 мл 0,4%-ного раствора гидроксида натрия. Растирание продолжают еще в течение 15-20 мин. После этого осадок или отфильтровывают, или, что лучше, отделяют путем центрифугирования. Центрифугат сливают в стакан и к нему прибавляют небольшими порциями (по 0,5 мл) 10%-ную уксусную кислоту до слабокислой реакции по лакмусу (2-3 мл). Полученный осадок нуклеопротеидов отделяют центрифугированием.

Гидролиз нуклеопротеидов.

Одним из простейших способов разложения рибонуклеопротеидов является нагревание их в течение 1 ч при 100°С в 10%-ном растворе серной кислоты.

Прежде всего, происходит расщепление нуклеопротеидов на белки и нуклеиновые кислоты. Далее белки гидролизуются до аминокислот, но в этих условиях гидролиз белка будет незначителен. Рибонуклеиновые кислоты в этих условиях расщепляются с образованием пиримидиновых нуклеотидов, пуриновые же нуклеотиды распадаются до пуринов, рибозы и фосфорной кислоты.

В колбу для гидролиза (с обратным воздушным холодильни­ком) помещают осадок нуклеопротеидов и 15 мл 10%-ного раствора серной кислоты. Колбу закрывают пробкой с проходящим через нее воздушным холодильником (трубка длиной 20-50 см и диаметром 0,7-0,8 см) и смесь кипятят на сетке в течение 1 ч., поддерживая только слабое кипение. Гидролизат отфильтровывают и в прозрачном растворе определяют наличие белков, пентозы, пуриновых оснований и фосфорной кислоты.

Обнаружение продуктов гидролиза.

Белки обнаруживают с помощью биуретовой реакции (см. лабораторную работу №2).

Пентозу (рибозу) обнаруживают по реакции с фелинговой жидкостью: к 1 мл реактива добавляют 1мл гидролизата и нагревают до кипения. Появляется осадок красно-кирпичного цвета.

Пуриновые основания обнаруживают по их реакции с аммиачным раствором оксида серебра. К 1 мл гидролизата приливают по каплям крепкий раствор аммиака до щелочной реакции по лакмусу и добавляют равный объем заранее приготовленного аммиачного раствора оксида серебра. Постепенно образуется осадок серебряных солей пуриновых оснований.

Фосфорную кислоту обнаруживают с помощью молибдата аммония или магнезиальной смеси.

К 2 мл раствора молибдата аммония в азотной кислоте прибавляют 1 мл испытуемого раствора. Смесь слегка нагревают. Образуется жёлто-зеленый осадок фосфоромолибдата аммония (NH₄)₃PО₄·12МоО₃.

К 2 мл гидролизата постепенно прибавляют концентрированный раствор аммиака до резкого запаха, после чего добавляют равный объем магнезиальной смеси. Образуется кристаллический осадок (потирание стеклянной палочкой) фосфата магний-аммония MgNH₄PО₄.