Методика определения концентрации витамина С

В работах [1,4] определение концентрации витамина С в образцах вишневого сока проводили по методу А. Н. Чупахиной, поскольку при ее определении методом титрования 2,6-дихлорфенолиндофенолом возникают трудности, связанные с определением окончания титрования. При реакции с аскорбиновой кислотой краситель, который имеет синий цвет, восстанавливается в бесцветное соединение. На окисление одной молекулы аскорбиновой кислоты расходуются две молекулы красителя. Избыток красителя в кислой среде имеет розовый цвет, что свидетельствует об окончании титрования. Но окраска раствора нестабильна и быстро исчезает. В связи с этим результат титрования во многом зависит от скорости титрования и освещения рабочего места.

Метод, предложенный А. Н. Чупахиной, основан на фотометрическом определении избытка 2,6-дихлорфенолиндофенола после восстановления его определенной части аскорбиновой кислотой [118]. Аскорбиновая кислота окисляется 2,6-дихлорфенолиндофенолом до дегидроаскорбиновой кислоты. 2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой среде – красную, а после восстановления обесцвечивается. Реакция проходит по такому механизму (рис. 3.2):

2,6-дихлорфенолиндофенол + L-аскорбиновая кислота→

2,6- дихлорфенолиндофенол лейкоформа + дегидроаскорбиновая кислота:

C₁₂Cl₂NO (OH) + C₆H₄O₂ (OH)₄ → C₁₂Cl₂NH (OH)₂ + C₆H₄O₄ (OH)₂.

Рис. 3.2 – Схема реакции окисления аскорбиновой кислоты

2,6-дихлорфенолиндофенолом

Оптическая плотность окрашенного раствора измеряется точно через 35 секунд после добавления в растительную вытяжку красителя, что позволяет полностью исключить недостатки метода титрования. Таким образом, количество L-аскорбиновой кислоты в растворе можно определить по изменению оптической плотности красителя. Оптическая плотность измеряется с помощью фотоэлектроколориметра.

Ход работы: 10 мл образца переносится в мерную колбу объемом 100 мл и его объем доводится до отметки 2% раствором метафосфорной кислоты (она используется для стабилизации аскорбиновой кислоты, а также для осаждения белков). Содержимое колбы встряхивают, фильтруют или центрифугируют. Из фильтрата берут три пробы по 10 мл и добавляют в них по 1 мл 0,025% раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. Секундомер включают сразу же после добавления красителя. Вытяжку с красителем тщательно перемешивают, смесь переносят в кювету толщиной 10 мм для колориметрирования.

Фотоэлектроколориметр настраивают 2% раствором метафосфорной кислоты, после чего контрольная кювета заменяется исследовательской. При колориметрировании стрелку гальванометра постоянно подводят к нулевой отметке в течение 35 секунд. Через 35 секунд проводится отсчет оптической плотности раствора. Используют зеленый светофильтр. В качестве контроля измеряют оптическую плотность смеси, которая состоит из 10 мл 2% раствора метафосфорной кислоты и 1 мл красителя. Изменение цвета исследовательского раствора пропорционально содержанию аскорбиновой кислоты в растительном материале.

Для расчета результатов используют разницу между оптической плотностью контрольного и опытного образцов. Содержание аскорбиновой кислоты рассчитывают с помощью калибровочного графика.

Если растительный материал содержит большое количество аскорбиновой кислоты (700 мг / г и более), весь краситель вступает в реакцию и обесцвечивается. В таком случае необходимо разбавить вытяжку метафосфорной кислотой в 2 раза (10 мл вытяжки и 10 мл кислоты) и добавить 2 мл красителя.

Построение калибровочного графика: 100 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 1 л 2% метафосфорной кислоты. Берут 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 мл этого раствора и разбавляют до 100 мл в мерных колбах 2% раствором метафосфорной кислоты. Полученные растворы содержат соответственно 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 мкг аскорбиновой кислоты в 1 мл.

Далее берут по 10 мл растворов аскорбиновой кислоты и по 1 мл красителя и определяют оптическую плотность этих растворов точно через 35 секунд после добавления красителя (как и в опыте). Параллельно определяют оптическую плотность смеси 10 мл 2% раствора метафосфорной кислоты и 1 мл 2,6-дихлорфенолиндофенола. Вычисляют разницу между оптической плотностью растворов, содержащих аскорбиновую кислоту и контрольного раствора. Полученные данные используют для построения калибровочного графика, откладывая их на оси ординат.

Необходимо учитывать, что аскорбиновая кислота быстро окисляется, особенно при ярком свете, поэтому измерение нужно выполнять при рассеянном свете и как можно быстрее.

Оборудование: фарфоровая ступка с пестиком; бумажные фильтры; центрифуга с центрифужными пробирками; мерные цилиндры объемом на 25 мл; пипетки объемом на 1 и 5 мл; конические колбы объемом на 100 мл; фотоэлектроколориметр.

Реактивы: 2% раствор метафосфорной кислоты; 0,025% раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола; 0,01 N раствор гидроксида натрия или калия.

Приготовление 0,025% раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола: 0,0625 г красителя 2,6-дихлорфенолиндофенола помещают в мерную колбу объемом на 250 мл и добавляют 150-200 мл дистиллированной воды и 6 капель 0,01 N раствора гидроксида натрия или калия. Содержимое колбы встряхивают в течение 10-15 минут до полного растворения красителя.

После достижения раствором комнатной температуры его объем доводят до 250 мл и тщательно перемешивают.