Лекция IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ

Одной из проблем на пути развития хирургии являлось отсутствие умения борьбы с кровопотерей. Хотя вопрос переливания крови интересовал людей издавна. Так у Гомера в Илиаде Одиссей в царстве теней поил их кровью, чтобы они смогли говорить. Папа Иннокентий VIII – глава католической церкви, будучи старым и больным в 1492 г перелил себе кровь от двух юношей. К сожалению все погибли. Иннокентий VIII от старости и дряхлости, а юноши от эмболии и гнойных осложнений. В те времена предпринимались попытки переливания крови от животных. В 1667 г врач Людовика XIV тяжелому больному перелил кровь ягненка. Несмотря на несовершенство методики, пациент выжил, но все следующие переливания закончились трагически. Таким образом, переливание крови в принципе не было возможным, так как отсутствовало учение о группах крови, не было консервантов, не соблюдались правила асептики. Переливание крови без учета их групповой совместимости может привести к агглютинации(склеиванию и разрушению) переливаемых эритроцитов. Из-за отсутствия консервантов кровь быстро подвергалась свертыванию, и возможно было только прямое переливание. Несоблюдение правил асептики способствовало инфицированию крови и передаче инфекционного начала пациенту. Отсутствие научного подхода к проблеме переливания крови порождало такие представления, как переливание крови от психического больного здоровому человеку сделает его тоже психически больным. С другой стороны больныхс расстройством психики лечили переливанием крови от здоровых людей. Все эти проблемы были решены в начале ХХ века (1901- 1907 гг.), благодаря открытию К. Ландштейнероми Я. Янскимгрупп крови. В 1914 г В.А. Юревич, Н.К. Розенгарти А. Гюстенпредложили для предупреждения свертывания крови использовать цитрат натрия. Лимоннокислый натрий, которым пользуются до сих пор, связывает ионы кальция, который является IV фактором свертывающей системы и кровь утрачивает способность к свертыванию. Лишь после этого стало возможным

научно обоснованное переливание крови и сформировалось новое направление в медицине – трансфузиология, наука занимающаяся вопросами переливания крови, ее компонентов (гемотрансфузия) и кровезаменителей.

Служба кровив настоящее время представляет собой специальную организацию в системе здравоохранения России. Во главе организационной структуры находятся научно-исследовательские институты гематологии и переливания крови(Москва, Санкт-Петербург, Киров). Они обеспечивают общее руководство, разрабатывая методические рекомендации, инструкции, организуют и проводят конференции по вопросам трансфузиологии, занимаются научно-исследовательской работой. В их подчинении находятся краевые, областные и городские станции переливания крови, которые непосредственно занимаются вопросами донорства, заготовкой, хранением и снабжением лечебных учреждений кровью и ее компонентами. В больницах имеются отделения или кабинеты переливания крови, где врач- трансфузиолог проводит все необходимые мероприятия для переливания крови и осуществляет гемотрансфузию. Переливание не было бы возможным без донорства. Донорэто человек, который добровольно дает часть своей крови, ткань, орган для переливания или пересадки больным людям (реципиентам). Донорство только добровольное, на любом этапе заготовки крови человек может отказаться от дачи крови. Допускается 5кроводач в год у мужчин и 4 - у женщин, перерыв между процедурами сдачи крови составляет 50-60 дней. Если человек сдавал кровь подряд 4-5раз, то перерывдолжен составлять 3 месяца. За 1 раз обычно сдают 200–500 мл крови, 600 мл плазмы, но не более 12 л плазмы в год. Донорымогут быть активными (кадровыми), которые за определенную плату сдают кровь 3-5 раз в год, находятся под постоянным наблюдением и регулярно обследуются, безвозмездными– кровь сдают по желанию в специально организованные для этого дни или в случаях каких-то катастроф, чрезвычайных происшествий, когда требуется большое количество крови для

пострадавших. Резервными донорамисчитаются люди (обычно с I группой крови), которые ранее сдавали кровь, находятся на учете на станции переливания и в случае необходимости готовы к даче крови. Иммунные доноры– абсолютно здоровые люди, которые подверглись иммунизации путем введения специфических антигенов, у них выработались антитела и от них заготавливают гипериммунную плазму (антистафилококковую, противостолбнячную и др.) или иммунные препараты (гамма-глобулин антистафилококковый, противогриппозный, противостолбнячный и др.). Донорами могут быть здоровые дееспособные люди в возрасте от 18 до 60 лет, которые проходят всестороннее обследование с обязательным определением носительства ВИЧ инфекции, гепатита В и С, сифилиса, цитомегаловируса.

К. Ландштейнером и Я. Янским все люди были разделены на 4 группы по наличию у них в крови определенных антигенов. В 1928 г. была утверждена международная классификация групп крови. Принято различать четыре группы: О(I), A(II), B(III) и AB(IV).В Европе 44%людей имеют группу крови A(II); группа О(I) является второй по частоте исоставляет 39%, группа B(III) встречается в 12%, группа AB(IV) – в 4-5%.Антигены крови являются наследственным признаком, не меняющимся в течение жизни. По своей природе антигены являются углеводно-белковыми комплексами, которые могут находиться на поверхности клеток крови или внутри них, но некоторые из них могут быть в водорастворимой форме в плазме крови, слюне, желудочном соке, моче, тканевой и других жидкостях организма. Для гемотрансфузиологии представляют интерес антигены поверхности форменных элементов крови, способные напрямую реагировать с антителом и являющиеся причиной посттрансфузионных осложнений. Вместе с тем деструкция клеток при онкологических и гнойно-некротических процессах, болезнях крови может сопровождаться «высвобождением» антигенов клеточной протоплазмы, к которым отсутствует «узнавание» иммунокомпетентных образований. Развивается аутоиммунный процесс.

Иммунные антитела могут оказаться способными агглютинировать как собственные эритроциты, приводя к их разрушению в сосудах и нарастанию анемии, так и переливаемые, что удается обнаружить при проведении проб на индивидуальную совместимость.

Известно более 700 различных эритроцитарных антигенов крови, образующих 75 агглютиногенных систем. Лишь 29 из них имеют клиническое значение, а наиболее значимы 14антигенных систем: АВО, Rh- Hr, Kell-Gellano, Duffi, Kidd, Lewis (Льюис), MNSs, Lutheran, Рp, Xq, Ji, Auberqer, Dieqo, Dombrok, Colton, Sciannaидругие. По каждой из этих систем существуют свои группы крови. Групповые антигены крови человека называют агглютиногенами, таккак они обычно выявляются реакцией агглютинации. Они обладают иммуногенностью, т. е. способностью вызывать образование иммунныхантител при поступлении антигена в организм, не имеющего его (антигены обладают этим свойством в разной мере) и специфичностью (серологической активностью), т. е. способностью вступать с соответствующим антителом в иммунологическую реакцию, такую, как агглютинация, преципитация и флокуляция.

Основной серологической системой, влияющей на развитие реакции совместимости или несовместимости при переливании крови является система АВ0. Это единственная система, которая содержит и врожденные агглютиногены А, В, 0 и врожденные агглютинины α и β. Агглютиногены содержатся в эритроцитах, а так же могут быть в лейкоцитах, тромбоцитах, тканевых клетках и плазме, а агглютинины находятся в сыворотке крови. Агглютинин α является антителом по отношению к агглютиногену А, а агглютинин β к агглютиногену В. При встрече одноименных агглютиногенов и агглютининов (А и α, В и β) развивается реакция агглютинации, поэтому в крови человека они не могут находиться одновременно. Антиген Оявляется самостоятельным слабым антигеном. Он выявляетсятолько специальными сыворотками и практическое его значение невелико. Генетически возможны

6 комбинаций аллельных антигенов – 00, А0, АА, В0, ВВ, АВ. Так как

гетеро- и гомозиготные варианты сочетаний антигенов (А0 и АА, В0 и ВВ) входят в одну группу, фенотипически выделяют четыре основные группы крови: Оαβ(I) – первая, Аβ(II) – вторая, Вα(III) – третья и АВ0(IV) – четвертая. Антиген Апредставлен несколькими разновидностями от А1 до А64, которые встречаются с неодинаковой частотой у лиц, имеющих кровь группы. Абсолютное число людей II группы крови имеют антиген А1(примерно у 88%), реже встречается антиген А2(до 12%). При наличии агглютиногена А1 его обозначают как А, а индекс используется лишь для А2. Другие разновидности антигена А встречаются исключительно редко, поэтому в трансфузиологической практике имеют значение только антигены А1 и А2 и соответственно этому подгруппы крови А и А2, АВ и А2В. Причем в подгруппу А2 и А2В входят антигены А: от А2 до А64 , а в подгруппы А и АВ только антиген А1. Антигены А1 и А2 отличаются по своей способности вступать в реакцию агглютинации с одноименными моноклональными антителами. Эритроциты подгруппы А1 дают крупнозернистую и быстро проявляющуюся агглютинацию, наступающую через 3-5 секунд. Эритроциты подгруппы А2 дают мелкозернистую агглютинацию, проявляющуюся к концу 3 минуты. Это имеет практическое значение, так чтобы не допустить ошибку при определении группы крови [вместо А(II) и АВ(IV) можно определить О(I) или В(III)], учет реакции агглютинации следует осуществлять не ранее чем через 3 минуты, ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигена А. Во избежание ошибок, если донор имеет подгруппу крови А2(II) или А2В(IV), то к контейнеру с эритроцитсодержащей средой прикрепляется специальная памятка для врача, определяющего группу крови из контейнера.

У лиц с подгруппами крови А(II) могут быть редко встречающиеся экстраагглютинины α2 [А(II)βα2 и АВ(IV)α2],а с подгруппой А2 – α1 [А2(II)βα1 и А2В(IV)α1]. Эти антитела не вызывают посттрансфузионных осложнений, однако проявляют себя в пробе на индивидуальную

совместимость. В частности, экстраагглютинин α1 агглютинирует эритроциты А1 на плоскости или в пробирках при комнатной температуре, поэтому реципиентам А2(II)βα1 переливают эритроцитсодержащие компоненты А2(II) или отмытые эритроциты 0(I) и свежезамороженную плазму А(II), реципиентам A2В(IV)α1 переливают одноименные эритроциты A2В(IV) или отмытые эритроциты 0(I) и В(III) групп, и свежезамороженную плазмуАВ(IV). Врожденный экстраагглютинин α2 дает агглютинацию с агглютиногенами О и A2. Однако экстраагглютинин α2 встречается в крови людей редко (1%) и в низком титре (1:2). Именно поэтому лица, в эритроцитах которых содержится фактор О, использовались в качестве универсальных доноров.

Человек с первой группой крови считается универсальным донором. О(I) Rh-отрицательныеэритроцитсодержащие компоненты можно вливать по жизненным показаниям в экстренной ситуации независимо от групповой и резус-принадлежности реципиента, если нет одногруппной крови или эритроцитсодержащих компонентов или нет времени на определение группы крови больного. Ранее реципиенты АВ(IV) группы крови считались универсальными реципиентамии в экстренной ситуации им можно было переливать донорскую кровь О(I), А(II) и В(III) групп. В настоящее время реципиентам АВ(IV)группы по жизненным показаниям могут быть перелиты только резус-отрицательные эритроцитсодержащие компоненты В(III) или, если нет времени для определения группы крови пострадавшего, резус-отрицательные эритроциты О(I) группы. Переливание крови универсального донора осуществляется только капельно, чтобы агглютинины разводились в крови реципиента.

Иногруппную кровь вводят только в экстренной ситуации для восполнения кровопотери в объеме не более 500 мл. Это соответствует прямому правилу Оттенберга: при переливании небольших доз крови (до 500 мл) учитываются агглютиногены переливаемой крови,т. к. именно они подвергаются агглютинации. Так, переливая кровь О(I) группы

пациентам А(II), В(III) и АВ(IV) групп, мы не вводим агглютиногены, и реакция агглютинации не развивается. Имеющиеся в плазме и тканевых жидкостях лиц с группой крови А(II), В(III) и АВ(IV) водорастворимые антигены А и В связывают вливаемые естественные агглютинины aи b универсального донора, снижают их титр и тем самым препятствуют гемолизу эритроцитов реципиента.

При переливании больших доз крови учитываются вливаемые и агглютиногены и агглютинины (обратное правило Оттенберга),т. к. количество агглютининов a и b будет достаточным не только для связывания водорастворимых антигенов А, В, но и для агглютинации собственных эритроцитов больного А, В, и АВ.

Универсальный донор, иммунизированный по эритроцитарным антигенам, или имеющий врожденный высокий титр естественных агглютининов, считается опасным универсальным донором,и переливание такой крови вызывает гемолиз эритроцитов реципиента. При переливании взрослому реципиенту 500 мл такой крови этот гемолиз не дает гемолитического шока, при трансфузии большего количества такая возможность вполне реальна.

Весьма редко обнаруживаются так называемые дефективные группы крови, когда обычными методами не выявляется какой-либо из естественных агглютининов (В₀, А₀, О_a, О_b, О₀₀) и возникают затруднения в определении группы крови перекрестным способом.

Еще более редкой является кровь типа «Бомбей», впервые описанная у одного из жителей Бомбея. (В настоящее время распространение такой разновидности крови зафиксировано в Средней Азии). В этом случае в эритроцитах отсутствуют антигены А, В и О (истинный «ноль»), а в сыворотках имеются агглютинины a, bи анти-О. Реципиентам с такой группой переливают только кровь типа «Бомбей», так как эритроциты универсального донора будут разрушаться антителами анти-О. Запасы такой

крови есть в Международном банке крови.

Иногда в организме человека одновременно находятся эритроциты, принадлежащие двум фенотипам АВО – кровяные химеры. Для истинного (врожденного) кровяного химеризмахарактерно наличие в организме двух генетически отличающихся клеточных популяций кроветворных клеток. В естественных условиях кровяной химеризм бывает у близнецов, которые наследуют от родителей разные группы крови, но организм остается толерантным к клеткам, вырабатывающим антигены другой группы крови. Ложный (временный, приобретенный) кровяной химеризмможет наблюдаться при трансплантации аллогенного костного мозга, или при переливании больному крови или эритроцитов универсального донора.

В трансфузиологии существует правило: любая «нестандартная» кровь донора для гемотрансфузии непригодна!

Агглютиногенная система резус (Rh-Hr)имеет 88 антигенов с их вариантами, составляющими полиаллельную систему. После антигенов АВО они имеют наибольшее значение для клинической практики. В трансфузиологии наибольшее клиническое значение имеют 6 антигенов. Для их обозначения используют две номенклатуры. По номенклатуре Wienera, предложенной в 1942 г., антигены резус обозначаются символами: Rh0, Rh', Rh'', Rh1w, Hr', Hr''.Другая номенклатура, предложенная в 1944 г. Fischer и

R. Race, использует буквенные обозначения: D, С, Е, Cw(вариант антигена С), c, e. Антигены резус, как и другие групповые признаки крови человека, наследуются от родителей и в течение жизни не изменяются. Они состоят из полипептидов, фосфолипидов и глико-протеиновых комплексов и находятся в мембране эритроцитов. Антигены D, С, Е наследуются по доминантному типу, а антигены c и e – по рецессивному. Наибольшей антигенной активностью (иммуногенностью) и, соответственно, наиболее частой причиной изосерологических конфликтов при гемотрансфузиях и беременности обладает антиген D(Rh₀), меньшей антигенной активностью обладает антиген С(rh'), с(hr'), еще меньшей – Е(rh''), затем – е(hr''). Антигенная активность D-фактора в 100 раз выше, чем у С-фактора.

Существование антигена d(Hr₀) не доказано (это гипотетический фактор), так как к нему неполучена соответствующая антисыворотка, и его написание означает, что фактор D отсутствует. Фактор D(Rh₀) содержится в эритроцитах 85% людей. Антиген С(rh') встречается у 70% людей, фактор с(hr') – у 80%, СW– у 2%, Е(rh'') – у 30%, а е(hr'') – у 97%.

При гемотрансфузиях пользуются весьма упрощенным и условным делением доноров и реципиентов на группы крови по системе резус, которое позволяет с минимальным риском осложнений осуществить переливание крови. Когда речь идет о реципиентах, прежде всего, следует учесть, что чаще вызывает иммунизацию при гемотрансфузиях антиген D(Rh₀), поэтому при переливании крови необходимо предупредить введение этого антигена с кровью донора реципиенту, у которого антигена D нет. В связи с этим среди реципиентов можно выделить две группы крови: резус-положительную (Rh+), к которой относится кровь всех лиц, имеющих в эритроцитах антиген D (упрощенно: DСЕ, DСе, DсЕ, Dсе), и резус-отрицательную (Rh-), к которой относится кровь всех лиц, не имеющих антигена D (упрощенно dCE, dCe, dcE, dce).

При таком разделении на группы, переливая резус-положительную кровь реципиентам с резус-положительной кровью, а резус-отрицательную кровь – реципиентам с резус-отрицательной кровью, можно предупредить иммунизацию по антигену D и избежать возможности тяжелых посттрансфузионных осложнений.

Если у доноров определять резус-принадлежность по тому же принципу, что и у реципиентов, то резус-отрицательная донорская кровь от 2-3% доноров будет содержать в эритроцитах антигены С или Е, и возможна иммунизация по этим факторам. В связи с этим к группе доноров с резус- отрицательной кровьюдолжны относиться только те лица, в эритоцитах которых нет доминантных резус-антигенов D, С, Е (в упрощенном варианте только комбинация dсе). Донорыже, в эритроцитах которых стандартными сыворотками обнаруживаются антигены D, С или Е, должны быть отнесены в

группу резус-положительных(упрощенно: DСЕ, DCe, DcE, Dce, dCE, dCe, dcE). Последние три группы доноров, в эритроцитах которых находятся антигены С или Е, могут быть выделены в отдельную группу, так как лицо, в эритроцитах которого обнаруживаются антигены С или Е, будучи донором, относится к группе резус-положительной, но, будучи реципиентом, должен считаться резус-отрицательным (ибо не имеет антигена D).

Иммунизация по Rh факторуможет происходить трансплацентарным, трансфузионным, трансплантационным и энтеральным путем. Иммунизация трансплацентарным путемпроисходит в том случае, если мать резус- отрицательная, а плод резус-положительный. В норме кровь матери и плода не смешивается. Однако при травме или заболеваниях, сопровождающихся отслойкой плаценты, а также во время родов, кровь плода (Rh-антиген) может попадать к матери, в результате чего происходит иммунизация и у нее вырабатываются иммунные антирезусные антитела. При следующей беременности резус-положительным плодом антитела проходят через плаценту, связываются с Rh-антигенами эритроцитов и приводят к их гемолизу (разрушению). В связи с этим может произойти выкидыш, рождение недоношенного ребенка с гемолитической желтухой. Иммунизация трансплантационным путемпроисходит при пересадке органов или тканей от резус-положительного человека резус- отрицательному. Иммунизация трансфузионным путемвозникает при переливании резус-положительной крови резус-отрицательному реципиенту. При первичном переливании у реципиента вырабатываются антирезусные антитела, а при повторном вливании резус-положительной крови происходит гемолиз переливаемых эритроцитов. В экстренной ситуации при отсутствии однорезусной крови возможно переливание резус-положительному человеку резус-отрицательной крови. Энтеральный путь иммунизациивозможен при поступлении резус-положительной крови в пищеварительный тракт резус-отрицательногочеловека.

Антигенная система Kellпо своей антигенной активности следуют за факторами системы резус. В систему Kell входят два фактора – Kell(K), встречающийся в 8-10% наблюдений, и Cellano(k), регистрируемый в 90,8%. В составе системы 24 антигена. Иммунизирующая активность фактора Kell соответствует активности фактора С(rh'). Сенсибилизация к фактору K может явиться причиной гемолитического трансфузионного осложнения или гемолитической болезни новорожденных, а также аутоиммунной гемолитической анемии. В настоящее время Kell-фактор определяется у всех доноров крови. Наиболее приемлемым методом для идентификации антигена Kell считается непрямая проба Кумбса. Kell-положительные компоненты крови для трансфузий в лечебную сеть не поступают, их направляют для переработки на препараты крови. Переливают только Kell-отрицательную кровь независимо от Kell-принадлежности реципиента. Донор, имеющий антиген K, может быть донором плазмы.

Кроме эритроцитарных существуют тромбоцитарные антигены человека и лейкоцитарные,последние являются антигенами гистосовместимости и учитываются при пересадке тканей и органов.

Для каждого антигена существуют одноименные антитела. Групповые изоантитела (агглютинины) крови представляют собоймолекулыгамма- глобулина и обладают свойством агглютинабельностит.е.способностью вызывать агглютинацию одноименных агглютиногенов (α и А, β и B) крови. Агглютинины могут быть естественными(врожденными), как в системе АВ0 (α и β) или иммунными(приобретенными), как в системе Rh-Hr (анти- Rh антитела). Врожденные агглютинины не выражены при рождении и развиваются лишь в течение первого года жизни и к концу этого периода их титр становится устойчивым, а полного развития они достигают к 18 годам. В старости же их титр снижается. В связи с этим у детей до 4-месячного возраста нельзя использовать перекрестный способ определения групп крови, т. е. группу крови можно определять только по цоликлонам и нельзя по стандартным эритроцитам. Иммунные агглютинины (анти-А, анти-В, анти-Д,

анти-Келл и др.) как правило, находятся в высоком титре. Титр сыворотки – это ее наименьшее разведение, при котором она еще способна вызывать в течение 3-минутного наблюдения отчетливую агглютинацию соответствующих эритроцитов. Обычным считается титр 1:16 или 1:32. Сыворотка с титром 1:32 в 2 раза активнее сыворотки с титром 1:16.

В зависимости от температурного оптимума, при котором агглютинины способны вызывать реакцию агглютинации, они делятся на холодовые и тепловые. Холодовые агглютинны(α и β) способны вызывать реакцию агглютинации при встрече с одноименными агглютиногенами в условиях комнатной температуры, а тепловые агглютинины(анти Rh) вне организма – при температуре 46-48°С.

В зависимости от условий, в которых протекает реакция агглютинации, они могут быть полными и неполными. Полные агглютинины(α и β) вызывают реакцию агглютинации при встрече с одноименными агглютиногенами и в солевой и в коллоидной среде. Агглютинин даже в солевой среде обеспечивает склеивание и разрушение сразу нескольких эритроцитов. Неполные агглютинины(IgG, таковыми чаще бывают анти-А, анти-В, антирезусные антитела) не могут вызывать реакцию агглютинации соответствующих агглютиногенов в солевой среде, эта реакция возможна лишь в присутствии коллоида (сыворотка, полиглюкин, желатина) либо при других определенных условиях (предварительное разведение, обработка эритроцитов ферментами). Среди них выделяют: неполные агглютинирующие, неполные скрытыеи неполные блокирующиеагглютинины. В живом организме они оказываются в благоприятных условиях и дают отчетливо проявляющуюся реакцию антиген-антитело. При попытке обнаружить их вне организма подходящие для реакции условия, близкие по температуре и коллоидным свойствам циркулирующей крови, приходится создавать искусственно. Так, неполные агглютинирующиеантитела могут быть обнаружены только в высокомолекулярной (коллоидной) среде. Вот почему при определении резус-принадлежности

крови с помощью стандартной антирезусной сыворотки, содержащей неполные антитела, исследуемые эритроциты следует брать в виде взвеси в их собственной сыворотке, добавлять 33% раствор полиглюкина или 10% желатина. Неполные скрытыеантитела – это агглютинины, находящиеся в сыворотке в чрезвычайно высоком титре (1:512-1:2048), препятствующем агглютинации «соседних» эритроцитов, несмотря на их встречу с одноименными агглютининами. Это явление получило название «феномена зоны». Вызвать агглютинацию и обнаружить неполные скрытые антитела при пробе на индивидуальную совместимость или определение группы крови стандартными эритроцитами возможно лишь после предварительного разведения в 8-16 раз и более сыворотки человека, анамнестически заподозренного в сенсибилизации. Разведение производится коллоидным раствором (чаще сывороткой АВ(IV) группы). Неполные блокирующиеантитела отличаются способностью адсорбироваться на эритроцитах без агглютинации. Эти антитела обнаруживаются с помощью антиглобулиновой сыворотки (непрямая проба Кумбса), а в случае скрытых антител – непрямой пробой Кумбса с разведением в 8-16 раз. Антиглобулиновую сыворотку получают путем иммунизации животных сывороткой человека. В результате этого у них образуются иммунные антитела против белков человека (антиглобулиновые антитела), и сыворотка, их содержащая, вызывает преципитацию неполных блокирующих антител, адсорбированных на эритроцитах. При этом эритроциты механически вовлекаются в реакцию склеивания, что выражается их агглютинацией.

Определение группы крови по АВ0 системевозможно 3 способами:

1. С помощью моноклональных антител (по цоликлонам), позволяющим установить наличие или отсутствие агглютининогенов в исследуемой крови.

2. Перекрестный способ определения групп крови, т. е. одновременно по цоликлонами при помощи стандартных эритроцитовв исследуемой крови определяют и агглютиногены и агглютинины.

Гелевая методика.

Определение групп крови по цоликлонам. Моноклональные анти-Аи анти-Вантитела продуцируются двумя различными мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Гибридома образуется путем слияния клетки опухоли костного мозга мыши с ее же иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома одновременно обладает свойствами и опухолевой клетки (неограниченно растет) и иммунного лимфоцита (синтезирует антитела). Цоликлоны изготавливаются из разбавленной асцитической жидкости мышей-носителей соответствующей внутрибрюшной опухоли гибридомы, продуцирующей специфические иммуноглобулины, направленные против группоспецифических антигенов А или В. Асцитическая жидкость с цоликлонами может подвергаться лиофильной сушке и длительно храниться. Непосредственно перед исследованием ее разводят изотоническим раствором хлористого натрия. Цоликлоны не содержат антител иной специфичности и поэтому не вызывают неспецифической агглютинации эритроцитов. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител. Технология изготовления реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами. Моноклональные антитела дают более быструю и более выраженную реакцию агглютинации с агглютиногенами А или В, и результат их взаимодействия можно учитывать через 3 минуты.

Определение группы крови производится методом прямой гемагглютинации на плоскости: на пластине или на планшете в помещении с хорошим освещением при температуре +15 - +25 градусов Цельсия.

А. На планшет или на пластину индивидуальными пипетками наносятся цоликлоны анти-А и анти-В по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.

Б. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,02-0,03 мл) и смешивают кровь с реагентом.

В. Пластину или планшет необходимо слегка покачивать в течение трех минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3-6 секунд, но наблюдение следует вести три минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А.

Г. Результат реакции может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации эритроцитов. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с цоликлонами проводится следующим образом. Если агглютинация с цоликлонами анти-А и анти-В не произошла, то это говорит о том, что в исследуемой крови нет агглютиногенов А и В и, соответственно, это O(I)группа крови. Если произошла агглютинация с цоликлоном анти-А и не произошла с анти-В, то в исследуемой крови присутствует агглютиноген А, нет агглютиногена В и это A(II) группа. Если произошла агглютинация с цоликлоном анти-В и не произошла с анти-А, то в исследуемой крови присутствует агглютиноген В, нет агглютиногена А и это B(III) группа. Цоликлоны не дают ложноположительных реакций, однако при некоторых онкологических заболеваниях, ожоговой болезни,аутоагглютинация возможна. В связи с этим при положительном результате реакции агглютинации с цоликлонами анти-А и анти-В дополнительно проводится исследование с цоликлоном анти-АВ, и, если с ним также произошла агглютинация, то необходимо, для исключения неспецифического характера агглютинации исследуемых эритроцитов, смешать на плоскости одну каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей физиологического раствора NaCl. Кровь можно отнести к группе АВ (IV)только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.

Определение группы крови перекрестным способомзаключается в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах испытуемой крови по цоликлонам и групповых агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов. Для определения группы крови перекрестным способом кроме моноклональных антител анти- А, анти-В и анти-АВиспользуют стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III).Учет реакции производится через пять минут путем сопоставления результатов, полученным по цоликлонам и стандартным эритроцитам. Результаты реакцийдолжны совпадать, т. е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут быть выражены в четырех различных комбинациях.

А. Исследуемая кровь не дала агглютинации с моноклональными антителами, что указывает на отсутствие в ней групповых агглютиногенов и принадлежность к группе О(I). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы О(I) и положительную – с эритроцитами групп А(II) и В(III). Это указывает на наличие в испытуемой крови агглютининов a и b, т. е. подтверждает ее принадлежность к группе О(I).

Б. При помощи моноклональных антител анти-А в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногена А. При этом сыворотка исследуемой крови не дает агглютинации со стандартными эритроцитами групп О(I) и А(II), т. е. она не содержит агглютинин a, но агглютинирует эритроциты группы В(III), т. е. в ее составе имеется агглютинин b, что указывает на принадлежность испытуемой крови к группе А(II).

В. При помощи моноклональных антител анти-В в исследуемой крови определяется наличие агглютиногена В. При этом сыворотка

исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными

эритроцитами групп О(I) и В(III), что подтверждает отсутствие агглютинина b, и положительную с эритроцитами группы А(II), что говорит о наличии агглютинина a и подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе В(III).

Г. При помощи моноклональных антител анти-А и анти-В в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногенов А и В. В этом случае в качестве контроля проводят исследование с цоликлоном анти-АВ. Если с ним также произошла агглютинация, то проводят пробу с физиологическим раствором хлористого натрия, отсутствие агглютинации с которым подтверждает специфичность реакции. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой крови, т. е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе АВ(IV).

При определении групповой принадлежности крови могут возникатьошибки двух родов. Ошибки первого родавозникают в том случае,если реакцияагглютинации не учитывается там, где она фактически есть или должна быть. Это может произойти: когда агглютинация начинается поздно или бывает слабо выражена при низкой активности реагента, или от того, что эритроциты исследуемого лица обладают слабой специфичностью, при избытке крови, если взята слишком большая капляпри высокой температуре (выше +25о С) окружающего воздуха, например, в жаркую погоду. Ошибки второго родавозникают в том случае, если реакцияагглютинации учитывается там, где ее нет или не должно быть. Это может произойти:когда эритроциты испытуемой крови складываются в

«монетные столбики», которые невооруженным глазом можно принять за агглютинаты,когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или панагглютинации, при использовании инфицированного образца крови больного,когда пластину со смесью эритроцитов и сыворотки не покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно, могут образовывать отдельные

скопления, симулирующие агглютинацию. Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи моноклональных антител других серий. Если результаты также остаются неясными, а определение проводилось только при помощи цоликлонов, то следует определить группу крови также и перекрестным способом или с помощью гелевой технологии.

В настоящее время разработана новая технология для определения антигенов эритроцитов, скрининга и идентификации антител, использующая комбинацию методов агглютинации и гель-фильтрации (гелевая методика). Все тесты проводятся в пластиковых диагностических карточках, которые содержат микропробирки, заполненные полиакриламидным гелем. Буферный гель может быть нейтральным, т. е. не содержать дополнительных компонентов, или же может содержать специфическую или антиглобулиновую сыворотку в структурной матрице геля. Исследуемые эритроциты или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем диагностические карточки центрифугируются. При центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов. При отсутствии агглютинации (отрицательная реакция) неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля, образуя компактный слой (осадок) на дне микропробирок ID-карты. Агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности геля или в его толще. Расположение агглютинатов в геле определяется силой агглютинации, и положительный результат может быть оценен от +1 до +4. Диагностическая система может быть использована для проведения всего спектра иммуногематологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, включая ABO/Rh типирование эритроцитов; типирование антигенов эрироцитовдругих систем; скрининги идентификацию антител