Этикетирование и фиксация проб. Ведение полевого дневника.

Для изучения водорослей в живом и фиксированном состоя­нии собранный материал делят на две части. Живой материал помещают в стерильные стеклянные сосуды (пробирки, колбы, баночки), закрытые ватными пробками, причем не заполняя их доверху, или в стерильные бумажные пакеты. Чтобы лучше сохранить водоросли в живом состоянии в экспе­диционных условиях, водные пробы упаковывают во влажную оберточную бумагу и помещают в ящики. Пробы должны периодически распаковываться и выставляться на рассеянный свет для поддержания фотосинтетических процессов и обога­щения среды кислородом.

Материал, подлежащий фиксации, помещают в чисто вымытую и высушенную стеклянную посуду (пробирки, бутыл­ки, баночки), плотно закрытую корковыми или резиновыми пробками. Водные пробы фиксируют 40%-м формальдегидом, приливая его в количестве 0,1 от объема собранной пробы. Водоросли, находящиеся на твердом субстрате (бумажные фильтры, галька, пустые раковины моллюсков и т.д.), зали­вают 4%-м раствором формальдегида. Хорошую сохранность водорослей и их окраски обеспечивает также раствор формаль­дегида и хромовых квасцов (5 мл 4%-го формальдегида и 10 г K₂S0₄ · Cr₂(S0₄)₃ • 24 Н₂0 в 500 мл воды). В полевых усло­виях можно также использовать раствор йода с иодидом калия. Раствор готовится следующим образом: 10 г KI раство­ряют в 100 мл воды, добавляют 3 г кристаллического иода и 100 мл воды, встряхивают до полного растворения кристаллов, хранят в темной склянке в течение нескольких месяцев. Его добавляют к пробе в соотношении 1:5. Герметически закупо­ренные фиксированные пробы можно хранить в темном про­хладном месте в течение длительного времени.

Собранные пробы тщательно этикетируют. На этикетках, заполняемых простым карандашом, указывают номер пробы, время и место сбора, орудие сбора и фамилию сборщика. Эти же данные фиксируют и в полевом дневнике, в который, кроме того, заносят результаты измерений рН, температуры воды и воздуха, схематический рисунок, подробное описание исследуемого водоема, развивающейся в нем высшей водной растительности и другие наблюдения.

Качественное изучение собранного материала. Материал предварительно просматривают под микроскопом в живом состоянии в день сбора, чтобы отметить качественное состоя­ние водорослей до наступления изменений, вызванных хране­нием живого материала или фиксацией проб (образование репродуктивных клеток, колоний, потеря жгутиков и подвиж­ности и т.д.). В дальнейшем его изучают параллельно в живом и фиксированном состоянии.

Работа с живым материалом является необходимым усло­вием успешного изучения преобладающего большинства водо­рослей, изменяющих форму тела, форму и окраску хроматофоров, теряющих жгутики, подвижность или даже полностью разрушающихся при фиксации. Чтобы сохранить собранный материал живым, его следует оберегать от перегрева, загрязне­ния фиксаторами, а изучение проводить как можно быстрее.

Водоросли в живом состоянии в зависимости от размеров и других особенностей изучают с помощью бинокулярной сте­реоскопической лупы (МБС-1) или световых микроскопов.

Для микроскопического изучения водорослей готовят пре­параты: на предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости и накрывают ее покровным стеклом. Если водорос­ли обитают вне воды, их помещают в каплю водопроводной воды или оводненного глицерина. Следует помнить, что при длительном изучении препарата жидкость под покровным стек­лом постепенно высыхает и время от времени ее необходимо добавлять. Для уменьшения испарения по краям покровного стекла наносят тонкий слой парафина или лак для ногтей.

При необходимости длительных наблюдений над одним и тем же объектом хороший результат лает метод висячей капли. На чистое покровное стекло наносят маленькую каплю иссле­дуемой жидкости, после чего покровное стекло, края которого покрыты парафином, парафиновым маслом или вазелином, накладывают каплей вниз на специальное предметное стекло с лункой посередине так, чтобы капля не касалась дна лунки. Такой препарат можно изучать в течение нескольких месяцев, сохраняя его в перерывах между работой во влажной камере.

При изучении водорослей, имеющих монадную структуру, серьезной помехой служит их подвижность. Однако при под­сыхании препарата движение постепенно замедляется и при­останавливается. Замедлению движения способствует также осторожное нагревание препарата или добавление вишневого клея. Подвижные водоросли рекомендуется фиксировать парами оксида осмия (при этом хорошо сохраняются жгути­ки), кристаллического иода (фиксация парами иода позволяет не только сохранить жгутики, но и окрасить крахмал, если он есть, в синий цвет, что имеет диагностическое значение), 4%-го формальдегида, слабым раствором хлоралгидрата или хлороформа. Длительность экспозиции над парами фиксато­ров устанавливают экспериментально, в зависимости от специ­фики объекта. Наиболее удобны для изучения слабофиксиро- ванные препараты, в которых часть водорослей потеряла подвижность, а другие продолжают медленно двигаться. Пре­параты следует изучать немедленно после фиксации, так как в течение короткого периода времени водоросли деформируются.

При изучении внутриклеточных структур, особенно у мел­ких жгутиковых, применяют окрашивание с помощью слабых растворов (0,005 — 0,0001%) нейтрального красного, метилено- вого голубого, нейтрального голубого, трипанового красного, бриллиант-крезилового синего, конго красного, зелени Януса, позволяющих более четко выявить клеточную оболочку, папиллы, слизь, вакуоли, митохондрии, аппарат Гольджи и другие органеллы.

Многие красители дают хороший результат лишь после применения специальных методов фиксации (при изучении фиксированных формальдегидом проб успешное применение красителей возможно только после тщательного отмывания исследуемого материала дистиллированной водой). Самый лучший фиксатор для цитологического исследования водорос­лей, в том числе изучения их ультраструктуры, — 1 — 2%-й раствор оксида осмия (раствор не подлежит длительному хра­нению). Водоросли, не имеющие настоящих клеточных оболо­чек, хорошо и быстро фиксируются метанолом. Раствор Люго- ля (1 г йодида калия и 1 г кристаллического йода в 100 мл воды) не только хорошо фиксирует водоросли, но и одновре­менно окрашивает крахмал в синий цвет.

Для изучения ядер успешно используют спиртово-уксусный фиксатор Кларка (три части 96%-го этилового спирта и одна часть ледяной уксусной кислоты) или жидкость Корнуа (шесть частей 96%-го этилового спирта, три части хлороформа и одна часть ледяной уксусной кислоты). Водоросли выдерживают в свежеприготовленном растворе фиксатора в течение 1 — 3 ч, затем промывают 96%-м этиловым спиртом (2 мин) и водой (10 мин). Следует подчеркнуть, что при цитологическом изуче­нии водорослей в большинстве случаев в зависимости от спе­цифики объектов экспериментальным путем подбирают наи­более эффективные фиксаторы, красители и время экспози­ции. Применяются и другие методы окраски ядер.

Жгутики изучают в световом микроскопе с помощью окрас­ки по Лефлеру. Для этого материал фиксируют оксидом осмия, на короткое время погружая в абсолютный спирт, и оставляют высохнуть. Затем добавляют несколько капель кра­сителя (смесь 100 мл 20%-го водного раствора танина, 50 мл насыщенного водного раствора FeS0₄ и 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина) и нагревают над пла­менем горелки, не доводя до кипения, до появления пара. После ополаскивания дистиллированной водой препарат в течение 10 мин докрашивают карболфуксином (100 мл 5 %-го водного раствора свежеперегнанного фенола и 10 мл насы­щенного спиртового раствора фуксина основного; смесь отстаивают в течение 48 ч, фильтруют и хранят в течение дли­тельного времени), затем снова ополаскивают дистиллирован­ной водой, дают высохнуть и заливают канадским бальзамом. Этим методом можно установить наличие или отсутствие на жгутиках волосков. Наблюдения за длиной жгутиков, характе­ром их движения, местом прикрепления ведутся на живом материале методом фазового контраста.

Хроматофоры следует изучать на живом материале, так как при фиксации они деформируются. Точно так же трудно сохранить и стигму. Белковое тело пиреноида после предвари­тельной фиксации хорошо окрашивается по Альтману. Краси­тель состоит из одной части насыщенного раствора пикрино­вой кислоты в абсолютном этиловом спирте и семи частей насыщенного водного раствора фуксина. Окрашивание длит­ся не менее 2 ч.

Окраску белковых тел пиреноидов можно осуществить и без предварительной фиксации материала с помощью уксусно­го азокармина G. Для этого к 4 мл ледяной уксусной кислоты добавляют 55 мл воды и 5 г азокармина G. Полученную смесь кипятят около часа, используя обратный холодильник, охлаж­дают, фильтруют и хранят в сосуде из темного стекла. Раствор красителя добавляют в каплю воды с водорослями на предмет­ном стекле, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом. Белковое тело пиреноида окрашивается в интенсивный красный цвет, остальная часть клетки — в светло- розовый.

Крахмал окрашивается в синий цвет под воздействием любых реактивов, содержащих йод. Наиболее чувствительный из них — хлорал йода (мелкие кристаллики йода в растворе хлоралгидрата) — позволяет обнаружить наиболее мелкие зер нышки крахмала и отличить крахмал вокруг пиреноида от строматического. Присутствие парамилона можно обнару­жить, растворив его 4%-м КОН. Наличие хризоламинарина выявляется лишь с помощью сложных микрохимических реак­ций. Масло и жиры окрашиваются Суданом (0,1 г Судана в 20 мл абсолютного этилового спирта) в красный цвет или оксидом осмия - в черный.

Вакуоли с клеточным соком становятся более заметными из-за прижизненной окраски слабым раствором нейтрального красного. Пульсирующие вакуоли можно наблюдать на живом материале в световом микроскопе благодаря их периодическо­му наполнению и опорожнению. Применение фазово-кон- трастного устройства, добавление 1%-го водного раствора танина, а также фиксация материала оксидом осмия облегчает выявление этих органелл.

Митохондрии хорошо окрашиваются (при свободном доступе кислорода) 0,1%-м раствором зелени Януса. Поэтому каплю воды с водорослями на предметном стекле накрывают покровным стеклом лишь спустя некоторое время после добавления красителя.

Аппарат Гольджи при фиксации материала оксидом осмия темнеет. Его можно окрасить также 0,5%-м водным раствором трипанового голубого. Содержимое клетки окрашивается в синий цвет 0,01%-м раствором метиленового голубого, в то время как аппарат Гольджи остается бесцветным.

При изучении видового состава водорослей определяют их размеры, являющиеся важными диагностическими признака­ми. Для измерения микроскопических объектов применяют окуляр-микрометр с измерительной линейкой. Цену делений окуляра-микрометра определяют с помощью объекта-микро- метра (предметное стекло с нанесенной на нем линейкой, цена каждого деления которой 10 мкм) индивидуально для каждого микроскопа и объектива (подробнее см. в кн.: Голлер- бах, Полянский, 1951). При изучении линейных размеров водорослей измерения желательно проводить для большого количества экземпляров (10 — 100) с последующей статистиче­ской обработкой полученных данных.

Все изучаемые объекты тщательно зарисовываются с помо­щью рисовальных аппаратов (РА-4, РА-5) и фотографируются микрофотонасадкой (МФН-11, МФН-12).

При идентификации водорослей следует добиваться точно­сти их определения. Изучая оригинальный материал, необхо­димо отмечать любые, даже незначительные отклонения в раз­мерах, форме и других морфологических особенностях, фик­сировать их в описаниях, на рисунках и микрофотографиях.

Методика количественного учета водорослей. Количествен­ному учету могут подвергаться пробы фитопланктона, фито- бентоса и перифитона. Данные о численности водорослей являются исходными для определения их биомассы и пересче­та других количественных показателей (содержание пигмен­тов, белков, жиров, углеводов, витаминов, нуклеиновых кислот, зольных элементов, интенсивность дыхания, фотосин­тез и т.д.) на клетку или единицу биомассы. Численность водо­рослей может быть выражена в количестве клеток, ценобиев, отрезков нитей определенной длины и др.

Учет численности планктонных водорослей производят при помощи счетных камер (Фукс-Розенталя, Нажотта, Горяева и др.) при увеличении микроскопа в 420 раз. Полученное по меньшей мере из трех подсчетов среднее количество водо­рослей пересчитывают на определенный объем воды.

Так как субстратом для поселения водорослей могут быть подводные предметы (камни, сваи, растения, животные и т.п.). то в одних случаях количество водорослей рассчитывают на единицу поверхности, в других — на единицу массы. Напри­мер, при обильном обрастании водорослями высших растений или водорослей-макрофитов можно применять метод непо­средственного взвешивания: сначала взвешивается обросшее растение, затем — после удаления с него эпифитов. Разница в весе дает биомассу оброста. Когда обрастание необильно, используют расчетный метод, т.е. с целого макрофита или с определенной навески его смывают оброст и разбавляют водой до известного объема (обычно не более 500 мл). Полу­ченную взвесь просчитывают под микроскопом так же, как и при обработке планктонных сборов, и пересчитывают на весь объем взвеси. Таким образом получают количество клеток эпифитных водорослей для всего растения или его навески.

Для учета крупных водорослей донных макрофитов (Fucus и др.) можно употреблять квадратные рамки размером 0,5 х 0,5 м (0,25 м²), 0,25 х 0,25 (0,0625 м²), 0,17 х 0,17 м (0,0289 м²); для мелких водорослей (Corallina и др.) — размером 0,1x0,1 м (0,01 м²) и 0,05 х 0,05 м (0,0025 м²). Рамка накладывается на заросли, и все попавшие в нее водоросли выбираются с помо­щью скальпеля или ножа и взвешиваются на технических весах в лаборатории с точностью до 0,1 г. Биомасса вычисляет­ся путем пересчета весовых данных на 1 м².

Количественная характеристика распределения макрофи­тов определяется путем разрезов в наиболее типичных местах. Ширина разреза может составлять 5—10 м, а его протяжен­ность, измеряемая рулеткой, зависит от уклона дна. На всем протяжении разреза через 0,5 — 25 м закладываются рамки количественного учета. Используя эту методику, можно опре­делить общую биомассу макрофитов и отдельных форм. Для выяснения биомассы необходимо знать площадь покрытия дна в пределах исследуемой зоны. Она определяется визуаль­но или точно (измерением).