Подавление устойчивости

Минимизация сопутствующего ущерба от применения антибиотиков может замедлить дальнейшую выработку устойчивости к ним, но не обязательно позволит снизить тот уровень устойчивости, которого микробы уже достигли на сегодняшний день. Надежды на то, что бактерии будут избавляться от генов устойчивости, как только перестанут в них нуждаться, давно пришлось похоронить. Теперь нам известно, что устойчивые к антибиотикам бактерии могут вполне успешно конкурировать со своими неустойчивыми родичами даже в организме человека, не прикасавшегося к антибиотикам уже не один месяц или не один год.

Хотя и наивно было бы надеяться на то, что нам когда‑либо удастся вернуть те следовые количества устойчивости, которые наблюдались до внедрения пенициллина, рано или поздно у нас в распоряжении могут оказаться технологии, позволяющие избирательно выключать бактериальную устойчивость, подавляя ген за геном и инфекцию за инфекцией. Одно из перспективных направлений последний в этой области касается “плазмидных рвотных” – химических соединений и других средств, побуждающих бактерий извергать из себя плазмиды – эти колечки ДНК, которыми они обмениваются, нередко под завязку набитые генами устойчивости. Первые попытки “лечить” от плазмид бактерий, устойчивых ко многим антибиотикам, были предприняты в семидесятых годах, когда микробиологи только начали разбираться в том, что представляют с0бой эти “факторы устойчивости”. В лабораторных условиях исследователям иногда удавалось очищать колонию бактерий от устойчивости к антибиотикам, воздействуя на нее токсичными веществами, например акридиновыми красителями, едкими детергентами или таким канцерогеном, как бромистый этидий.

В то время подобные токсичные вещества казались совершенно непригодными для лечения пациентов. Что серьезные побочные эффекты некоторых антибиотиков, используемых сегодня в качестве последнего средства, заставили ученых вернуться к исследованиям препаратов, очищающих бактерий от плазмид. Например, припадки, к которым иногда приводит антибиотик имипенем, считаются теперь “допустимым” побочным эффектом при лечении инфекций, вызываемых устойчивыми к ванкомицину энтерококками или устойчивыми ко многим антибиотикам псевдомонадами (Pseudomonas) или ацинетобактерами (Acinetobacter). К сожалению, ни одно средство “лечения от плазмид” не действует ни на все разновидности плазмид, ни даже на большинство из них, а некоторые бактерии носят с собой сразу несколько их разновидностей.

Более безопасный и более эффективный подход будет, возможно, найден благодаря исследованиям механизмов, позволяющих бактериям передавать свои коллекции плазмид дочерним клеткам. Бактерии, как и все клетки размножаются делением, хотя механизм деления у них намного проще, чем у более крупных и сложнее устроенных клеток растений и животных. Оказывается, плазмиды содержат собственный генетический аппарат для независимого удвоения и наследования. Более того, они должны жестко контролировать этот процесс: при каждом делении клетки в ней всегда должно быть достаточно плазмид, чтобы раздать их следующему поколению, но не слишком много, чтобы их количество внутри отдельной бактериальной клетки не стало чрезмерным.

Пол Хергенротер, долговязый химик‑вундеркинд из Иллинойсского университета, считает, что сложность механизма размножения плазмид дает ученым достаточно возможностей испортить этот механизм – либо заставив плазмиды “думать”, что их слишком много (и тем самым выключив их удвоение), либо приведя в негодность их аппарат распределения копий по дочерним клеткам36. В 2006 году исследовательской группе Хергенротера удалось реализовать первый из этих двух вариантов с помощью молекул небольшого, похожего на антибиотик вещества апрамицина, имитирующего сигнал о том, что плазмид стало слишком много. В клетках кишечной палочки, которым в среду добавляли это вещество, плазмиды устойчивости переставали удваиваться, и с каждым новым поколением дочерним клеткам доставалось все меньше плазмид. После смены примерно 250 поколений (кишечные палочки делятся в среднем раз в двадцать минут) в их колониях почти не осталось плазмид, и они стали вполне уязвимы для антибиотиков, которые еще три дня назад не оказывали на них никакого действия. Ясно, что врачам понадобится более быстродействующее средство для очистки бактерий от плазмид, если они будут использовать его в сочетании с антибиотиками. Но успех Хергенротера стал важнейшим шагом в этом направлении.

Другой способ борьбы с такими плазмидами состоит в том, чтобы найти гены, используемые некоторыми бактериями для включения и выключения содержащихся в этих плазмидах генов устойчивости. Такая “индуцируемая устойчивость” создает ужасные проблемы при лечении некоторых Разновидностей бактериальных инфекций, потому что их возбудители могут, судя по результатам лабораторных анализов, казаться восприимчивыми к определенному антибиотику, а во время лечения пациента неожиданно включать гены устойчивости. Однако выключатели этих генов привлекают медиков как перспективные мишени для средств, подавляющих устойчивость микробов к антибиотикам. Например, в английском Бристольском университете специалистка по молекулярной биологии Вирве Энне занимается поисками выключателя, который в нормальных условиях подавляет активность целой плазмиды устойчиво‑ стиукишечной палочки. Эта плазмида, когда она включена, делает кишечную палочку неуязвимой для тетрациклина, ампициллина, стрептомицина и сульфаметоксазола – четырех антибиотиков из числа наиболее широко используемых в медицине. К началу 2007 года исследовательнице удалось сузить область поисков “регуляторного переключателя” этой плазмиды до одной из нескольких групп генов. Когда она найдет этот переключатель, следующая ее задача будет состоять в том, чтобы разобраться, какого рода сигналы его запускают и как их можно заблокировать.

Разумеется, плазмиды – не единственное хранилище генов устойчивости. Некоторые из таких генов, попадая в бактерию на плазмиде, тут же перескакивают в главную хромосому. Другие возникают в результате мутаций или встраиваются в хромосому вместе с ДНК бактериофагов (вирусов, которые заражают бактерий) или конъюгативных транспозонов (своего рода перескакивающих генов). Надежда во всех этих случаях прежде всего на один или несколько методов прямого выключения генов – на так называемые антисмысловые генетические технологии. Эти технологии предполагают искусственное создание фрагментов ДНК с обратной последовательностью, блокирующих работу соответствующих генов. Самым известным примером применения таких технологий был не имевший коммерческого успеха сорт помидоров “Флавр‑Савр”, выведенный в начале девяностых. Специалисты по генной инженерии получили этот медленно созревающий сорт, введя в него антисмысловой ген, частично блокировавший синтез гормона созревания, что позволяло фермерам собирать уже зрелые (а значит, более ароматные) помидоры, не боясь, что они сгниют по дороге к покупателю. Незначительно улучшенного аромата оказалось недостаточно, чтобы преодолеть недоверие покупателей к генетически модифицированному “Франкенфрукту”, но сам факт его получения был выдающейся демонстрацией возможности антисмысловых технологий.

Примерно в то же время, когда “Флавр‑Савр” совершал свой непродолжительный дебют, команда Стюарта Ливи в Университете Тафтса начала работу над созданием анти‑ смыслового гена, блокирующего работу гена устойчивости ко многим антибиотикам mar (multiple‑antibiotic‑resistance), обнаруженного у множества близкородственных болезнетворных микробов, в том числе сальмонелл (возбудителей пищевых отравлений), шигелл (возбудителей бактериальной дизентерии), чумных палочек (возбудителей чумы) и дюжины с лишним возбудителей внутрибольничных инфекций: энтерококков, цитробактеров, серраций и клебсиелл. Ген таг представляет собой своего рода центральный переключатель для целого набора генов устойчивости, делающих микробов невосприимчивыми к десяткам антибиотиков, от давних стандартных средств, таких как тетрациклин и ампициллин, до перспективных новых препаратов таких как норфлоксацин. Ливи и его коллеги встроили Щученный антисмысловой ген к гену таг в плазмиды помощью минутного повышения температуры до 42 °C и электрического импульса побуждали клетки кишечной палочки поглощать такие плазмиды. Этот метод, конечно, нельзя было использовать на практике для борьбы с болезнетворными микробами, но он открывал многообещающее новое направление исследований.

Но с тех пор как Ливи продемонстрировал саму подобную возможность, ряду других ученых удалось добиться аналогичных результатов, побуждая бактерий в пробирках поглощать антисмысловые последовательности, лишавшие их устойчивости к ванкомицину в одном эксперименте и к амикацину в другом. (Амикацин – довольно токсичное средство, особенно часто применяемое при тяжелых формах внутрибольничных инфекций, устойчивых ко всему остальному.) Как и в случае с методами чистки от плазмид, конечный успех работ, ведущихся в этом направлении, целиком и полностью зависит оттого, удастся ли найти практические способы заставить бактерий делать то, что от них требуется, в организме пациента. С другой стороны, обнадеживает то, что микробиологи в настоящее время исследуют сразу несколько возможных способов введения антисмысловых генов в бактериальные клетки. Например, такие гены можно упаковывать в бактериофагов, или заключать в маленькие жировые пузырьки, легко проходящие через клеточные стенки бактерий.