Коконы и лягушачья слизь

Примерно в то же время, когда западная наука повторно открыла методы фаговой терапии, научные журналы полнились сообщениями о еще одном “естественном” средстве борьбы с микробами. Молекулы антимикробных пептидов состоят из крошечных цепочек аминокислот – как в молекулах белков, только меньше. До 1981 года их совсем не замечали среди множества более сложных бактерицидных веществ, содержащихся в слезах, слизистых выделениях и других жидкостях многоклеточного организма. Но в тот год шведский микробиолог Ханс Боман выделил два антимикробных пептида (АМП) из покоящихся куколок гигантской ночной бабочки церкопии (Hyolophora cecropio) и назвал их в ее честь церкопинами. Церкопины, выделенные Боманом, убивали широкий набор бактерий, но оказались совершенно безвредными для небактериальных (эукариотических) клеток. Это замечательное открытие частично объясняло, как насекомые и другие беспозвоночные животные противостоят инфекциям, не имея антител, Г‑клеток и β‑клеток, которыми вооружены более “адаптивные” иммунные системы высших животных. Четыре года спустя патолог из Калифорнийского университета в Лос‑Анджелесе Роберт Лерер открыл, что в организме человека (а вероятно, и в организмах всех других форм многоклеточной жизни) АМП тоже синтезируются. Он обнаружил их упакованными в пожирающие бактерий иммунный клетки – так называемые нейтрофилы. Лерер назвал эти человеческие АМП дефензинами.

Идея использовать АМП в медицине в качестве противобактериальных препаратов пришла в следующем, 1986 году в голову одному сердобольному исследователю из Национальных институтов здравоохранения, имевшему привычку не убивать подопытных лягушек, у которых он извлекал икру, а оставлять их в живых и зашивать разрезы, которые дЛЯ этого требовалось сделать. Майкл Заслофф изучал работу генов на удобном материале – больших и прозрачных икринках шпорцевой лягушки. Введя самке лягушки обезболивающее и хирургическим способом удалив ее икру, он тратил несколько секунд на то, чтобы наскоро зашить разрез, и выпускал лягушку обратно в мутную воду аквариума, к ее сестрам. Однажды, доставая нескольких мертвых старых лягушек из этой зеленой воды, Заслофф обратил внимание на примечательное состояние тех лягушек, которых он уже оперировал. Хотя он не только не стерилизовал свой скальпель, но и не чистил сколько‑нибудь регулярно аквариум, разрезы на теле этих лягушек прекрасно заживали, без малейших признаков воспаления. Заслофф заподозрил, что в слизистой коже земноводных должна содержаться особенно сильно действующая разновидность вещества, подобного церкопинам Бомана или дефензинам Лерера.

Гомогенизировав образцы кожи нескольких лягушек, которыми пришлось пожертвовать, он выделил два антимикробных пептида, обладавших, как он утверждал, широким антибиотическим действием, причем более сильным, чем какое‑либо другое из известных науке веществ. Он назвал их магайнинами – от слова, означающего на иврите “щит”, и в 1987 году опубликовал свои открытия, получившие широкое признание. В прессе вокруг антимикробных пептидов, как и вокруг фазовой терапии, вскоре поднялась шумиха. После хвалебной заметки в разделе новостей “Нью‑Йорк тайме” опубликовала редакционную статью, где достижения Заслоффа ставились в один ряд с достижениями не только Александра Флеминга, открывшего пенициллин, но также Говарда Флори и Эрнста Чейна, потративших десяток лет на то, чтобы сделать из пенициллина работающий лекарственный препарат. “Д‑р Заслофф благодаря огромным возможностям современных биологических технологий, прошел все этапы сам, причем всего за один год”, – писали редакторы, отмечая, что это открытие приспело как нельзя вовремя, чтобы спасти человечество от нарастающей критической ситуации с устойчивостью к антибиотикам. “Даже если сбудется лишь часть из того, что обещают лабораторные эксперименты с этими веществами, – говорилось в заключении статьи, – это все равно будет означать, что д‑р Заслофф сумел найти достойного преемника пенициллину”.

Дальнейшие исследования показали, каким образом антимикробные пептиды избирательно губят бактерий. Их молекулы несут слабый положительный заряд и поэтому прилипают к отрицательно заряженным наружным поверхностям бактериальных мембран, но не к почти лишенным заряда мембранам животных клеток. Прилипнув к поверхности микроба, молекула пептида меняет свою форму так, что пронзает оболочку клетки. Пронизанная такими отверстиями, бактерия “истекает кровью”, только в обратном направлении: она гибнет от воды, хлещущей в клетку снаружи.

Заслофф полагал, что нашел у микробов настоящую ахиллесову пяту. “Несмотря на свое древнее происхождение, антимикробные пептиды по‑прежнему остаются эффективными орудиями защиты, опровергая всеобщее убеждение, что бактерии, грибы и вирусы могут выработать устойчивость к любому вообразимому веществу и рано или поздно ее выработают”, – заявлял онб4. Казалось, что бактериям, чтобы выработать устойчивость к этим пептидам, пришлось бы принципиально изменить физическую структуру своих мембран, изменив их электрический заряд, что невозможно, как доказывали Заслофф и его единомышленники. Такая самоуверенность была настоящим искушением судьбы. Но результаты исследований Заслоффа, судя по всему, подтверждали этот вывод.

Заслофф и спонсоры его исследований вскоре организовали частную компанию для финансирования клинических испытаний. Как практикующий педиатр, а не только как исследователь, Заслофф был особенно увлечен разработкой на основе АМП средства для лечения муковисцидоза ν маленьких пациентов. В 1997 году, работая в Пенсильванском университете, он принял участие в исследованиях, показавших, что эта болезнь развивается, по крайней мере отчасти, из‑за дефективных дефензинов, работающих в легких. Тем временем полученные им ранее результаты вызвали настоящий бум открытий других антимикробных пептидов и получения патентов на них, каждый из которых мог принести миллиарды долларов в этом жаждущем новых антибиотиков мире.

К 1998 году Заслофф испытал эффективность своих магайнинов в качестве средства от стрептодермии (бактериального кожного заболевания) и диабетических кожных язв на тысяче с лишним добровольцев. В обоих случаях АМП показали умеренную эффективность в подавлении и профилактике инфекций. Этого было достаточно, чтобы вызвать интерес такого фармацевтического гиганта, как компания SmithKline Beecham, которая собралась выпустить разработанный Заслоффом антибиотический крем под названием “Лоцилекс”. Но весной следующего года на пути этого препарата к покупателям возникла внезапная преграда, когда консультативный совет Управления пищевых продуктов и медикаментов, обсуждавший возможность окончательного одобрения, объявил о том, что хотя безопасность лоцилекса и была убедительно показана, его эффективность требовалось подтвердить дополнительными исследованиями.

Это решение вызвало бурю гнева среди обнадеженных диабетиков и внезапную утрату интереса со стороны компании SmithKline Beecham. Но другие исследования, связанные с АМП, продолжали идти полным ходом. При этом всеобщая уверенность в безопасности АМП была так велика, что Заслофф даже предложил сделать на основе другого продукта его компании, акульего АМП сквала‑ мина, средство для подавления аппетита. Испытания, проведенные на мышах, дали неожиданный результат, показав, что этот пептид способствует сокращению приема пищи. К 2001 году число открытых антимикробных пептидов уже приближалось к пятистам, а в научной литературе вышли тысячи связанных с АМП статей. В том же году Майкл Шнаерсон и Марк Плоткин опубликовали книгу “Убийцы внутри нас” – пугающее описание смертоносного распространения устойчивых к антибиотикам бактерий. В заключительных главах авторы, уважаемые научные журналисты, говорили об антимикробных пептидах наравне с методами фаговой терапии как о двух главных надеждах на спасение современной медицины.

Но вскоре два специалиста по эволюционной биологии плеснули воды на разгоревшееся вокруг АМП пламя энтузиазма. В июне 2003 года Грэм Белл из канадского Университета Макгилла и Пьер‑Анри Гуйон из Сорбонны опубликовали в журнале Microbiology полемическую статью, озаглавленную “Вооружаем врага”. В этой статье они предупреждали о том, что какими бы безопасными АМП ни казались в ближайшей перспективе, если их использование приведет к выработке устойчивости, то последствия могут оказаться катастрофическими. “Эволюция устойчивости к любому антибиотику, разумеется, делает его менее эффективным для лечения заболеваний, – писали они. – При этом она отнимает у любого синтезирующего этот антибиотик организма часть его антибактериального арсенала. В обычных случаях это не вызывало бы тревоги, но в данном случае антибиотик синтезируем мы сами”. Теоретически выработка устойчивости к АМП могла бы приведи к возникновению бактерий, неуязвимых для тех самых веществ, – их человеческий организм использует в качестве первой линии обороны. Побочным эффектом могли стать небольшие царапины, которые больше не заживают, глазные и респираторные инфекции, вызываемые микробами, повсюду летающими в воздухе. Даже самые невинные из бактерий, обитающих у нас в организме, стали бы вызывать тяжелые заболевания.

Предостережение Белла и Гуйона вызвало ошеломление, а затем возмущенную реакцию со стороны множества старателей, работающих на новом фармацевтическом поле антимикробных пептидов. Первым, кто ответил на эту статью в научной прессе, был сам Заслофф, который отверг возможность выработки устойчивости к АМП как “невероятную” и назвал логику Белла и Гуйона “принципиально ошибочной”. Он доказывал, что в распоряжении бактерий были миллионы лет на выработку устойчивости к этим веществам, но этого так и не случилось. Бросая Беллу личный вызов, Заслофф писал, что тот может попробовать использовать пексиганан, один из особенно широко испытываемых магайнинов, воздействуя на каких угодно микробов в какой угодно концентрации в течение какого угодно времени. “Готов спорить, что этот пептид не вызовет появления устойчивости”, – сказал он репортерам. Белл принял этот вызов, и оба ученых согласились опубликовать результаты этой работы в совместной статье.

Из двадцати четырех бактериальных культур, которые выращивались в лаборатории Белла под влиянием пексиганана, двадцать две выработали устойчивость к этому препарату. Как же удалось специалисту по эволюционной биологии добиться выработки устойчивости, которую не смогли выявить микробиологи, такие как Заслофф? Белл и один из его студентов‑младшекурсников, Габриэль Перрон, воспользовались проверенным методом отбора и выведения устойчивых организмов. Они начали с того, что стали выращивать свои бактериальные штаммы (двенадцать разновидностей кишечной палочки и двенадцать синегнойной палочки) в бульоне, в который была добавлена чрезвычайно низкая доза пексиганана, что, по сути, гарантировало выживание хотя бы нескольких клеток. Каждое утро Перрону приходилось выделять выжившие клетки и переносить их в новую пробирку. При этом доза пексиганана каждые несколько дней повышалась вдвое. Это давало немногим выжившим мутантам время для накопления дополнительных мутаций, которые могли усилить их устойчивость. Этот процесс, хотя его осуществление в лабораторных условиях и требует немалого труда, чем‑то похож на то, что может происходить с бактерией, когда она распространяется и размножается в организмах или какой‑либо другой среде, где присутствует антибиотик одной из существующих разновидностей.

Будучи специалистом по эволюционной биологии, а не генетиком, Белл оставил другим выяснение того, какие конкретно мутации давали микробам, живущим в содержащей АМП среде, возможность выжить. Его дело было сделано: он доказал, что даже если бактерии и не вырабатывают устойчивости к антимикробным пептидам в природе, длительное применение этих веществ в больших концентрациях (то есть именно то, что происходит при лечении инфекций) принципиально меняет характер давления отбора и устойчивость может вырабатываться. Что же касается Заслоффа, он принял этот результат с редким достоинством для человека, посвятившего почти двадцать лет работы антибиотикам, к которым, по его твердому убеждению, невозможно было выработать устойчивость.

“Если что‑то может случиться в пробирке, весьма вероятно, что это может случиться и в реальной жизни”, – заявил он накануне публикации результатов исследования. Белл, в свою очередь, согласился с Заслоффом, что такие результаты не должны послужить поводом для отказа от изучения антимикробных пептидов, но должны стать предупреждением, требующим более осторожного подхода к десяткам препаратов, готовящихся к применению в медицине и ветеринарии. Помимо более строгих проверок на устойчивость, Белл и Заслофф убеждали ученых исследовать также возможность перекрестной устойчивости, то есть подробнейшим образом проверять, могут ли АМП различных организмов, например насекомых, рыб или лягушек, вызывать выработку устойчивости к АМП человека, а также домашних и сельскохозяйственных животных. Такая перекрестная устойчивость с давних пор создает трудности при использовании обычных антибиотиков, выделяемых даже такими дальними родственниками, как грибы и бактерии (представители двух совершенно разных царств живой природы).

Более безопасный и перспективный подход состоит, возможно, в том, чтобы повышать уровень собственных антимикробных пептидов в организме пациента. И Заслофф и Белл высказались в поддержку этого подхода, сопряженного с меньшей угрозой выработки устойчивости, потому что у нас в организме АМП используются в сочетании со многими другими защитными средствами, такими как антитела или противобактериальные ферменты. В ходе первого испытания на животных лекарства, использующего этот подход, исследователям из Швеции и Бангладеш удалось вылечить зараженных шигеллами кроликов с помощью бутирата натрия – соли одной из жирных кислот, в норме присутствующей в толстой кишке в следовых количествах. Сам по себе бутират лишен антибиотических свойств.

Однако он стимулирует выработку кишечником кателицидина – мощного антимикробного пептида, не дающего бактериям прикрепляться к нежным клеткам выстилки кишечника. В эксперименте с кроликами те из них, кто получал бутират, начали выздоравливать от бактериальной дизентерии в течение суток, в то время как состояние контрольной группы, получавшей плацебо, продолжало явственно ухудшаться.

В ходе другого исследования из той же области, связанного с клетками иммунной системы человека, Роберт Модлин из Калифорнийского университета в Лос‑Анджелесе установил, что витамин D усиливает выделение этими клетками дефензинов, а также их способность уничтожать возбудителей туберкулеза в клеточной культуре. Это открытие, возможно, объясняет пользу “лечения солнцем”, применявшегося в начале XX века в санаториях для туберкулезных больных, поскольку солнечный свет стимулирует естественную выработку витамина D нашей кожей. Кроме того, команда Модлина показала, что у людей африканского происхождения, отличающихся повышенной предрасположенностью к туберкулезу, сыворотка крови в меньших концентрациях содержит как витамин D, так и противомикробные пептиды – скорее всего потому что темная пигментация кожи предохраняет ее от воздействия солнечных лучей. Модлин уже перешел к клиническим испытаниям этого лабораторного открытия, которые должны показать, могут ли недорогие витаминные добавки повышать устойчивость к туберкулезу у представителей темнокожих народов. Значение данного открытия особенно велико в свете недавнего появления почти неизлечимых штаммов XDR ТВ, то есть крайне устойчивых к антибиотикам (eXtreme‑Drug Resistant) возбудителей туберкулеза.

Тем временем, несмотря на недавно открывшуюся обратную сторону медали, интерес к разработке лекарственных препаратов на основе антимикробных пептидов охраняется. Если тревоги по поводу перекрестной устойчивости к человеческим АМП окажутся напрасными, такие препараты могут оказаться безопасными и существенно продлить золотой век антибиотиков. Но стодневный эксперимент Белла и Перрона напоминает нам, что все, что убивает бактерий, неизбежно способствует также выработке и распространению устойчивости. Принимая во внимание эту суровую реальность, кажутся безрассудством надежды на то, что даже самое осмотрительное использование существующих и быстрая разработка новых антибиотиков позволят добиться чего‑нибудь большего, чем отсрочка очередного кризиса.

Как наивно бы это ни звучало во времена, когда о супер‑ микробах‑убийцах трубит вся пресса, среди ученых растет единодушное убеждение, что пора перейти от эскалации войны с микробами к поиску мира в том мире, который был и останется миром бактерий. И это не какая‑то отвлеченная философия: исследования, ведущиеся в этом направлении, уже начали приносить результаты.