Иммунологический анализ антигенов и антител с помощью меченых реагентов.

Для определения антигенов и антител разработаны многочисленные варианты иммунологического анализа, которые предусматривают исполь­зование различным образом меченых реагентов.

Разнообразные метки.

Радиоактивное мечение изотопом ¹³¹I, а в последнее время все чаще ¹²⁵I -это многократно проверенный и надежный метод. Однако из-за того что необходимые в этом случае реагенты опасны для здоровья и нестабильны в результате радиоактивного распада, были предложены и другие типы меток. Успешно применяют ферменты, в частности пероксидазу и фосфатазу, которые при добавлении к реагирующим компонентам соответствующего субстрата образуют окрашенные продукты реакции. На использовании ферментов основан, в частности, метод определения антител, а иногда и антигенов, называемый ЕLISA (от англ.- твердофазный иммуноферментный анализ). Один из способов усиления фосфатазной реакции заключается в том, чтобы использовать в качестве субстрата НАДФ, который под действием фермента превращается в НАД и может служить коферментом для второй ферментативной системы. Все большую популярность приобретает конъюгация с биотином, поскольку биотин легко выявляется с помощью комплекса фермент - авидин. Авидин связывается с биотином с фантастической специфичностью и сродством. Кроме того, широко используются хемилюминесцентные и флуоресцентные метки.

Жидкофазный иммунологический анализ.Выявление антител.

Если к антисыворотке добавить некоторый избыток меченого антигена, то большинство молекул антител со средней аффинностью образуют комплексы с антигеном. Преципитация этих комплексов и последующее определение количества содержащейся в них метки позволяет оценить способность сыворотки связывать антиген.

Рис.20 . Определение антигенсвязывающей емкости сыворотки с помощью меченого антигена (используют ¹²⁵1 или какую-нибудь другую метку). Радиоактивность преципитата служит мерой антигенсвязывающей емкости.

Используя антитела к различным классам и подклассам иммуногло-булинов, можно определить , активность антител различных классов. Например, добавление радиоактивно меченного антигена к сыворотке человека и последующая преципитация комплексов с помощью кроличьих антител к человеческому IgА позволяет определить количество , антигена, способного связываться с сывороточным IgА.

Выявление антигена в классическом радиоиммунологическом анализе (РИА).

Связывание радиоактивно меченного антигена с ограниченным количеством антител можно уменьшить добавлением немеченого антигена. По степени уменьшения связывания определяют количество немеченого антигена в добавленном материале.

Рис.21. Принцип радиоиммунологического анализа (здесь вводятся упрощающие предположения о высокой авидности и моновалентности антител).

а. Если к трем молям радиоактивно меченного Аг (красные кружки) добавить 2 моля Ат, один моль Аг останется свободным, а два свяжутся с антителами. Соотношение радиоактивности свободного и связанного Аг составит 1:2.

б. Если к Ат добавить 3 моля немеченого Аг (черные кружки) и моля меченого Аг, вновь лишь 2 моля Аг свяжутся с Ат. Поскольку Ат не могут отличить меченый Аг от немеченого, то с Ат свяжется лишь половина меченого Аг. Соотношение свободной и связанной радиоактивности составит 2:1. Ясно, что оно зависит от количества добавленного немеченого Аг, и поэтому можно построить калибровочную кривую.

Разные варианты метода отличаются между собой тем, каким образом свободный антиген отделяют от антигена, связанного с антителами.

С разработкой методов мечения антигенов до высокой удельной активности появилась возможность выявлять очень низкие концентрации антигена. Таким способом сейчас удается определять большинство белковых гормонов. Один из недостатков заключается в том, что данные методы не позволяют различать активные белковые молекулы и биологически неактивные фрагменты, тем не менее сохранившие антигенные детерминанты. РИА успешно используют и для определения канцероэмбрионального антигена, антигенов вируса гепатита и низкомолекулярных веществ, таких, как стероиды, простагландины и соединения группы морфина (для получения со­ответствующих антител эти низкомолекулярные вещества конъюгируют с иммуногенным носителем).