Технология выделения и кратковременного хранения ооцитов.

В настоящее время применение на практике нашел метод созревания ооцитов in vitro. Их выделяют из яичников коров двумя способами:

1 способ: - Яичники получают от животного после убоя, в процессе разделки туши в условиях мясокомбината.

-Доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере и не более 1,5 – 2 ч хранят в солевом растворе Хенкса с добавлением антибиотиков или в среде ТСМ – 199 при температуре 10 - 20°С;

- Ооциты выделяют из фолликулов диаметром около 4 - 6 мм путём отсасывания или посредством предварительного иссечения яичников лезвием на пластинки.

2 способ - прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора лапароскопа. Этим прибором ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 5 мм, 1-2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем за один раз получают 5-6 ооцитов, из них от 30 до 50% пригодных для выращивания in vitro.

Несмотря на низкий выход ооцитов при извлечении, остаётся реальной возможность многократного использования животных высокой племенной ценности, что открывает новые перспективы применения метода оплодотворения in vitro в практических целях.

Отобранные ооциты, с компактным кумулюсом, помещают в среду ТСМ 199, добавляют 20%-й раствор тёплой сыворотки крови от коровы в охоте, гранулёзные клетки (5х10⁶ клеток в 1 мл) и небольшое количество антибиотиков (50 ИЕ пенициллина, 50 мкг стрептомицина на 1 мл). Гранулёзные клетки собирают из среды, в которой ооциты были отделены от фолликулов и центрифугируют дважды по 5 мин при 3000 об. Осадок гранулёзных клеток суспензируется в среде для созревания. Культивирование ооцитов, вместе с гранулёзными клетками, проводят в термостате – инкубаторе при 38,5°С, при содержании в атмосфере 5% СО₂, в чашках Петри в 2 мл среды.

Капацитация сперматозоидов.Важным этапом в разработке метода оплодотворения ооцитов у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г М. Чанг и одновременно с ним Г. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том случае, если спермии в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проникновения спермиев в яйцеклетки крысы в различные сроки после спаривания, Г. Аустин ввёл термин капацитация. Он доказал, что в сперме должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретёт способность к оплодотворению.