Криоконсервация полученного генетического материала

Существует два основных способа глубокого замораживания эмбрионов:

1. Контролируемая медленная (постепенная) криоконсервация;

2. Несбалансированная криоконсервация с а) ультрабыстрым замораживанием и б) витрификацией.

Контролируемая медленная криоконсервация является в настоящее время обычным методом консервации эмбрионов. Их охлаждают медленно, чтобы: а) произошло обезвоживание зародыша и уменьшилось образование больших внутриклеточных кристаллов льда; б) жидкость вышла за пределы клеток и более крупные кристаллы льда образовывались только в межклеточном пространстве; в) зародыши оставались в равновесии с замерзающим раствором. При этом если клетки охлаждаются слишком быстро, существует опасность повреждения эмбриона из-за межклеточной и внутриклеточной кристаллизации. Кроме того, растущая концентрация солей в межклеточном растворе может вызвать токсическое повреждение эмбриона. Для такой медленной криоконсервации необходим дорогостоящий импортный замораживатель (стоимостью около 12 тысяч евро), а сам процесс длится два с половиной часа.

При ультрабыстрых методахзамораживания эмбрионы, находящиеся в растворе 3,5-4,5 М ДМСО (диметилсульфоксид) и 0,25-0,5 М сахарозы, помещают в жидкий азот. При этом образующиеся мелкие кристаллы льда, менее стабильные, чем острые крупнокристаллические и тающие при очень низких температурах, не оказывают разрушительного воздействия на тканевую структуру зародыша.

Под витрификацией понимают переход жидкости в твердое состояние, который вызван не кристаллизацией, а повышением вязкости во время охлаждения. Витрификационная жидкость состоит из смеси высококонцентрированного (10-25%) проникающего криопротектора (ДМСО, ацетамид, пропиленгликоль, глицерин, этиленгликоль) и непроникающего криопротектора (полиэтиленгликоль, фиколл, сахароза) в буферном солевом растворе. При витрификациизначительно упрощается не только процесс охлаждения, поскольку эмбрионы после кратковременной выдержки в витрификационном растворе сразу погружаются в жидкий азот, но и исключается опасность физических и химических повреждений, вызванных межклеточной и внутриклеточной кристаллизацией воды, к тому же здесь не нужно дорогое компьютеризированное оборудование. Единственным недостатком витрификации является химическая токсичность витрификационных растворов, которая находится в прямой зависимости с концентрацией криопротектора, временем и температурой экспозиции эмбриона в этом растворе.

Технологические этапы процесса криоконсервации эмбрионов. Использование технологии криоконсервации зародышей позволяет сохранить генетически ценный эмбриоматериал при отсутствии реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью.

Технология глубокого замораживания и оттаивания эмбрионов предусматривает следующие этапы:

1. Оценка качества полученных эмбрионов.

2. Насыщение зародышей криопротектором.

3. Постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей.

4. Перенос их в жидкий азот на хранение.

5. Оттаивание эмбрионов при определенной температуре.

6. Выведение криопротектора из зародышей.

7. Морфологическая оценка эмбрионов под микроскопом на пригодность к трансплантации.

8. Заправка эмбриона в пайету и далее в катетер.

9. Пересадка эмбрионов реципиентам.

Методика приготовления криопротектора глицерина. В качестве криопротектора для замораживания эмбрионов на стадии развития поздней морулы или ранней бластоцисты и получивших оценку не ниже «хорошо», может использоваться 1,4М раствор глицерина. Методика его приготовления приведена в таблице 5.3.

Таблица 5.3. Методика приготовления раствора глицерина

Насыщение эмбрионов криопротектором осуществляется либо поэтапно в возрастающих концентрациях растворов, либо одноступенчато, как это показано в таблице 5.4.

Все работы с эмбрионами проводят с использованием стерильной посуды, инструментов и оборудования. После выдержки зародышей в растворе с конечной концентрацией криопротектора соблюдают следующие правила подготовки:

Таблица 5.4. Схема насыщения эмбрионов криопротекторами

а) эмбрионы с помощью шприца объемом 1 см³ помещают в пайеты, при заправке которых соблюдают следующую последовательность их заполнения (рис. 5.2);

Рис. 5.2. Схема заправки пайеты с эмбрионом

1 - пыж, 2 - защитный раствор, 3 - пузырек воздуха, 4 - эмбрион, 5 - пайета,

6 - маркировочная пробка

– вначале набирают раствор криопротектора в количестве 2/5 объема;

– затем пузырек воздуха;

– снова раствор с эмбрионом (1/5 объема);

– пузырек воздуха;

– раствор криопротектора (2/5 объема).

б) заправка проводится таким образом, чтобы введенный первым объем раствора, постепенно продвигаясь дальше, смочил пыж пайеты;

в) в одну пайету заправляют не более 2-х эмбрионов;

г) нижний конец пайеты закрывают пластиковой маркировочной пробкой, на которой указывают дату извлечения эмбриона, номер коровы-донора, номер быка производителя, номер пайеты;

д) рекомендуется использовать следующие наиболее распространенные иностранные марки программных замораживателей: Миникул АС-25; CryoCell 1200; DB1 EmbryoFreeze.

Режимы замораживания приведены в инструкциях к замораживающим устройствам.

Пайеты с эмбрионами переносят в камеру для замораживания и включают программу. Схема прибора для замораживания представлена на рис. 5. 3.

			1.Морозильная камера   2.Блок автоматики с датчиком температуры   3.Сосуд Дьюара   4.Электронное клапанное ус-тройство   5. Фиксатор для пайет

Рис. 5. 3. Схема программного замораживателя

Снижение температуры происходит автоматически до заданного программой уровня. Затем пайеты быстро переносят в жидкий азот для хранения (рис. 5.4).

Рис. 5. 4. Перенос пайеты из замораживателя