ГИБРИДИЗАЦИЯ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Роль изолированных протопластов в селекции. Гибридизация соматических клетокосуществляется методом слияния протопластов, изолированных из соматических клеток растений, и применяется для создания новых генотипов, новых форм растений. Использование изолированных протопластов позволяет решать множество теоретических и практических задач. С их помощью можно вести селекцию на клеточном уровне, работать в малом объёме с большим числом индивидуальных клеток, осуществлять прямой перенос генов, изучать мембраны, выделять пластиды.

Протопласты непременно участвуют в соматической гибридизации. Термин «соматическая гибридизация», означающий процесс слияния протопластов соматических клеток, был введён Дж. Мельхерсом в 1974 году.

Соматическая гибридизация имеет важные особенности. Во-первых, этому процессу доступны практически любые скрещивания. Во-вторых, слияние протопластов способствует объединению цитоплазматических генов родительских клеток, чего не бывает при скрещивании половых клеток.

Самопроизвольное слияние протопластов не происходит, поэтому учёными, после длительных исследований, разработан механизм этого процесса. Установлено, что протопласты имеют отрицательный поверхностный заряд, что вызывает их взаимное отталкивание. Для осуществления слияния это отталкивание научились преодолевать специальными приёмами, способствующими снятию поверхностного заряда мембран. Впервые искусственное слияние протопластов с помощью индуктора слияния (фьюзогена) было осуществлено в 1970 году Е. Коккингом. В настоящее время в качестве эффективных фьюзогенов используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) и растворы с рН 9-11 и высокой концентрацией ионов кальция. Механизм слияния протопластов при использовании ПЭГ состоит в высокой концентрации этого вещества (20-30%), что способствует поглощению всей свободной воды между протопластами, вызывая их слияние в результате дегидратации. Кроме того, поглощение свободной воды индуцирует образование пор в мембране, через которые перетекает внутриклеточное содержимое. Повреждения мембран обратимы, поэтому слившиеся протопласты регенерируют клеточную стенку (рис. 4.1). Кроме того, существует физический фактор активизации воздействия на мембраны – импульсы электрического тока, которые также заставляют протопласты сливаться. Обработка электрическими импульсами, как и обработка ПЭГ, приводит к обратимому повреждению мембран. Применение переменного тока вызывает диэлектрофорез, и протопласты, находящиеся между электродами, выстраиваются в ряд, примыкая друг к другу своими полярными поверхностями. Импульс постоянного тока приводит к образованию пор, через которые происходит слияние (рис. 4.2).

При соматической гибридизации развиваются клетки двух типов: гибриды и цибриды.

Рис. 4.1.Слияние протопластов под действием полиэтиленгликоля

1 – изолированные протопласты; 2 - слияние протопластов в результате дегидратации; 3 - образование пор в мембране протопласта; 4 – перетекание через поры внутриклеточного материала; 5 – гибридный протопласт

Рис. 4.2.Слияние протопластов под действием электрического тока

1 – изолированные протопласты; 2 – слияние протопластов полярными поверхностями; 3 - образование пор в мембранах под воздействием сильного импульса постоянного тока; 4 – смешивание цитоплазмы; 5 – образование гибридных протопластов

При образовании гибридов объединяется ядерный геном обеих клеток. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнёров, а ядро – одного. Такой результат достигается при деградации одного из ядер после слияния или в том случае, если один из протопластов был лишён ядра.

Первый неполовой гибрид высших растений был получен в 1972 году при слиянии изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и Nicotiana langsdorfii. В настоящее время получено много межвидовых и межсемейственных гибридов, значительную часть которых нельзя считать нормальными растениями, а некоторые гибриды (гибрид арабидопсиса и турнепса) представляют собой растения – монстры. Возникающие аномалии – результат хромосомной несбалансированности. Описаны случаи возникновения гибридов между протопластами эритроцитов крысы и дрожжевых клеток, моркови и человека и др.

Любые исследования, любые манипуляции в области создания новых генотипов должны быть тщательно и всесторонне продуманы, а учёные должны помнить об ответственности и научной этике. Профессор Колумбийского университета Э. Чаргафф предупреждал о том, что «в тысяче опытов, вероятно, ничего не случится, но затем в одном каком-то случае произойдёт нечто очень неприятное». Он был «убеждён, что именно попытка преобразовать или перехитрить природу некогда приведёт её к гибели».

Глава 5

ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ IN VITRO. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ