Сохранение генофонда

Сохранение разнообразия форм жизни – важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Ещё Г. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия – единственный механизм стабильности жизни на Земле.

Кроме того, чтобы обеспечить питанием растущее население нашей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с расширением городов, сельскохозяйственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить.

Существует несколько способов сохранения генофонда высших растений: заповедники, национальные парки, банки семян. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т. е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196°С). Криосохранение имеет существенные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико-химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде.

Генофонд и факторы, влияющие на него. Генофондом называют заложенную в организмы генетическую информацию, определяющую их рост и развитие. Установлены следующие факторы, влияющие на генофонд организмов: ультрафиолетовая (УФ) радиация, тяжелые металлы, отходы промышленности. Воздействие каждого из этих факторов может вызвать изменения биологических свойств организма и даже приводить к его исчезновению.

В настоящее время экологическая обстановка на нашей планете оказывает значительное влияние на генетический аппарат многих живых организмов. Некоторые виды находятся под угрозой исчезновения. В связи с этим проблема сохранения генофонда растений и животных приобретает особое значение.

Традиционные способы сохранения генофонда. Сохранение разнообразия форм жизни - важнейшая проблема современного человечества. Уже давно доказано, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Поэтому сохранение биоразнообразия является единственным механизмом обеспечения стабильности жизни на Земле.

Традиционные способы – заповедники, ботанические сады, коллекции семян растений не лишены недостатков.

Так, заповедники не дают полной гарантии сохранения всех видов растений произрастающих на их территории. Это обусловлено расширением сельскохозяйственных угодий и несанкционированной вырубкой лесов (рис. 3.29).

В ботанических садах обычно сохраняются только определенные виды растений или отдельные их представители (рис. 3.30).Все это делает необходимым создание новых способов для сохранения разнообразия генофонда растительных и животных организмов, а также человека, например коллекции семян растений (рис. 3.31) и сохранение генофонда в условиях in vitro.

Сохранение генофонда растений в условиях in vitro. Данный приём подразумевает использование коллекций: каллусных культур растений, а также растений в пробирках и суспензионных культурах. Разработка методов культивирования клеток и тканей в условиях in vitro позволила использовать их для сохранения генофонда различных растительных объектов (рис. 3.32-3.34).

При работе с растущими коллекциями необходимо поддерживать без изменений состав питательных сред, размер пересаживаемых культур, длительность культивирования, а также условия выращивания (температуру, влажность, освещенность). Растущие коллекции постоянно оцениваются по ряду параметров (рост, жизнеспособность клеток, митотическая активность, содержание вторичных соединений и др.). Сравнение штаммов сразу по нескольким признакам может быть облегчено использованием компьютерных программ.

В Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (г. Москва) имеется большая коллекция, включающая 182 единицы хранения, из которых 85 являются каллусными и суспензионными культурами, а 97 – растениями в пробирках. Штаммы раувольфии (Rauwolfia serpentina) и женьшеня Panax ginseng поддерживаются в этих условиях более 40 лет и сохраняют присущие им свойства, в том числе способность к синтезу биологически активных соединений (алкалоидов и стероидов).

Депонирование коллекций растительных клеток in vitro.

В настоящее время разработаны методы так называемого «депонирования» коллекций, которые позволяют существенно удлинить период между пересадками культур. Это связано с тем, что периодическое субкультивирование клеточных культур растений трудоемко и требует значительных затрат, как на выполнение работ, так и на приготовление питательных сред для культивирования.

Установлены следующие методы, используемые для депонирования:

- выращивание культур при низких положительных температурах (1-10°С) и слабой интенсивности освещения (до 50 люкс);

- добавление к среде осматиков (маннита, сорбита или повышенных концентраций сахарозы);

- снижение атмосферного давления (до 0,5 мм рт. ст.);

-включение в питательную среду веществ, тормозящих рост культур, например, абсцизовой кислоты (5-10 мг/л) или ССС (хлорхолинхлорида - 2 г/л);

- гипоксия (выращивание под слоем минерального масла для уменьшения доступа кислорода).

Депонированные коллекции растительных культур могут расти без пересадок в течение 1 года и даже больше. В ряде случаев удачным является одновременное использование нескольких подходов, например, выращивание при низкой температуре и в присутствии веществ, тормозящих рост клеток.

Криосохранение и его возможности. Криосохранение – один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Оно позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С). Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным и не подвержен изменениям, которые происходят с организмами при хранении обычными способами.

Развитие криобиологии (науки о действии низких температур на живые организмы) началось в 1900 году, когда К. Линде и Дж. Дьюар получили в значительных количествах жидкий воздух, состоящий из азота и водорода. Выдерживаемые в нём бактерии в дальнейшем не только оживали, но и сохраняли свои свойства.

В 1938 году было проведено глубокое замораживание сперматозоидов человека, часть которых выжила. Но сохранять спермии ряда домашних животных и птицы (быков, петухов) научились только 10-11 лет спустя. Вскоре на коммерческой основе были организованы первые настоящие криобанки спермы лучших быков-производителей. В настоящее время достигнуты значительные успехи в сохранении яйцеклеток, эмбрионов мышей и сперматозоидов человека.

Теоретическое обоснование криосохранения. Основными критическими моментами криосохранения являются образование льда внутри и вне клеток организма и их дегидратация (обезвоживание).

Образование внеклеточного и внутриклеточного льда заключается в том, что снижение температуры окружающей среды ниже точки замерзания раствора приводит к его переохлаждению, образованию льда вокруг клеток и возникновению центров кристаллизации. Вода выходит из клеток и замерзает на поверхности внешнего льда.

Образование внутриклеточного льда обычно повреждает клетки, и только в случае формирования очень мелких (стеклообразных) кристаллов льда они могут дальше развиваться.

Животные и растительные клетки. Клетки растений являются более трудным объектом для криоконсервации, чем клетки животных. Это связано с их более крупными размерами: размер растительной клетки 15-1000 мкм, а размер клеток животных 7-25 мкм. Кроме того, растительные клетки содержат специальные органоиды - прочную целлюлозную стенку. Особенно осложняет обезвоживание наличие системы вакуолей. Центральная вакуоль в клетках растений может занимать до 90% от их общего объёма, что затрудняет их обезвоживание.

Технология криосохранения базируется на закономерности, чтопри криосохранении (криоконсервации) клетки переходят в состояние глубокого анабиоза и после длительного пребывания в нем возвращаются в обычное (нормальное) состояние.

Основные этапы криосохранения.

1. Предварительное культивирование клеток или организмов. При этом учитывают устойчивость их к воздействию состава среды культивирования, а также соответствие возраста, стадии роста и количества клеток перед извлечением.

2. Расфасовка подготовленного материала в контейнеры. При этом для замораживания и хранения подготовленных клеток или организмов используют разнообразные типы контейнеров. Расфасовку проводят в стерильных условиях (рис. 3.35).

Рис. 3.35. Контейнерыдля хранения3. 36. Программный заморажи -