Клонирование клеток и трансгеноз.

Метод культуры клеток позволяет получить большое количество клеток - потомков одной первоначально взятой родительской клетки. Этот метод называется клонированием. Клон клеток - это совокупность клеток, имеющих происхождение от одной исходной клетки в результате митоза. В основе клонирования лежит фундаментальное свойство живого – способность к репликации, т.е. воссозданию, синтезу себе подобного. Такие клетки имеют совершенно идентичный геном.

В начале 70-х годов ХХ в. научились клонировать клетки. В течение 10 – 12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно делиться митозом. Г. Келлер и У. Мильштейн в 1974 – 1975 г. разработали методику получения гибридных клеток, одна из которых опухолевая (миелома), а вторая – нормальный лимфоцит. Получающиеся гибридные клетки имели какую-то часть хромосом нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и какую-то часть от опухоли. Росли только клетки, унаследовавшие способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например, антител. Неограниченно делящиеся клетки клонировали, т.е. рассадили по одной (каждую в отдельную посуду) и получили клоны клеток. Такие клетки назвали гибридомами. Если гибридома синтезирует антитела, то их называют моноклональными. Такие антитела являются не только продуктами моноклона, но и чистыми препаратами одинаковых иммуноглобулинов. В конце 70-х годов научились выращивать in vitro и клонировать Т-лимфоциты. Это стало возможным только после открытия фактора роста для Т-лимфоцитов, позже названного интерлейкином-2 (IL-2).

Следующим методическим этапом исследования природы стало клонирование генов (молекулярное клонирование) – получение чистого клона гена и вслед за ним чистого клона молекул белка, кодируемого этим геном. Для того, чтобы клонировать конкретный ген, сначала надо узнать первичную последовательность нуклеотидов этого гена. Необходимо было также научиться искусственно синтезировать короткие отрезки ДНК (20 – 30 нуклеотидов) со строго заданной последовательностью нуклеотидов (олигонуклеотидов), используемых в качестве затравки (праймера) для синтеза длинных молекул ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Для клонирования ДНК ее вначале подвергают диссоциации (расплетанию) путем нагревания до 92 – 95^оС (термоденатурации). В результате данного метода можно получить миллионы копий исследуемого гена. Этот метод получил название полимеразная цепная реакция (ПЦР), впервые описанный в 1983 г. Керри Б. Мюллисом. За прошедшие годы этот метод получил широкое распространение во всем мире.

Получив столь «мощный» метод биосинтеза отдельных генов в чистом виде, стали «делать» трансгенных мышей и мышей с направленным разрушением определенного гена. Трансгенная мышь – это мышь, в геном которой введен посторонний экзоген. Чтобы сделать трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ДНК, строго воспроизводящую последовательность заданного экзогена. Самку мыши спаривают с самцом, после чего из самки быстро извлекают оплодотворенную яйцеклетку. Микроманипулятором в мужской пронуклеус ниъецируют ДНК экзогена. Такие яйцеклетки имплантируют в матку или яйцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки и ждут от нее потомство. Опыт показывает, что примерно 25% новорожденных мышат несут экзоген (теперь уже трансген) в своем геноме. В первом поколении мышей трансген находится в гетерозиготном состоянии. Таких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. Теперь они являются полноценными трансгенными мышами. С помощью трансгенных мышей были получены важные сведения о том, как осуществляется регуляция генов млекопитающих и каким образом некоторые гены (онкогены) обусловливают возникновение рака.

В последние годы получает развитие новая область медицины, так называемая биомедицина. Задачами этого направления медицины являются создание технологий сохранения, доставки, интеграции и функциональной актуализации в организме пациента средств молекулярной и клеточной терапии. Основой клеточной технологии является использование стволовых клеток. Разработана и реализуется программа исследований «Стволовые клетки и их использование в медицине». Поскольку стволовые клетки полипотентны, они могут развиваться в любом направлении - мышечных, нервных, эпителиальных и др. Стволовые клетки взрослого организма сохраняются в небольшом количестве, обеспечивая регенерационные способности тканей.

Различают несколько субклассов стволовых клеток:

- ранние эмбриональные стволовые клетки – клетки бластоцисты 1 –2 недели, тотипотентные;

- широко специализированные стволовые клетки – клетки гаструлы – нейрулы 3 – 4 нед., мультипотентные;

- ограниченно специализированные (фетальные) – клетки обновляющихся растущих тканей взрослого, составляют 1 – 2%, олигопотентные;

- фенотипически детерминированные – региональные стволовые клетки, из которых можно вырастить в культуре разные клетки; например, клетки костного мозга в культуре могут расти в разных направлениях.

Стволовые клетки используются для изучения:

- общих закономерностей эмбриогенеза человека;

- создания моделей болезней человека;

- закономерностей экспрессии генов в эмбриогенезе;

- разработки методов выделения и поддержания в культуре с сохранением их пролиферативных потенций;

- факторов клеточной дифференцировки;

- генотерапии;

- преодоления дефицита тканей для трансплантации.

Источниками стволовых клеток могут быть эмбрионы, искусственно выращенные эмбрионы, эмбриональные карциномы, премордиальные гаметоциты, клетки костного мозга, пуповинные и плацентарные клетки. Стволовые клетки используются для эмбрионального клонирования.

Если стволовые клетки ввести животному внутривенно, то они обнаруживаются в разных органах. Клонирование удается, если ввести ядро стволовой клетки, а не дифференцированной клетки взрослого организма. Такие клетки можно использовать для лечения болезней человека. Для этого их выделяют из организма (например, из ребра у добровольцев), обрабатывают в определенном направлении в культуре. Берут яйцеклетку у донора, ядро яйцеклетки микроманипулятором удаляют и вводят ядро обработанной соматической клетки. Затем клетка дифференцируется в определенном направлении (например, в нейральную) и ее вводят больному человеку. В Англии разработана методика клонирования эмбриональных клеток свиньи.

Стволовые клетки уже используются в медицине при ожогах. Таким способом выращивают кожу для трансплантации. Получены положительные результаты при лечении болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и др. Стволовые клетки могут быть материалом для выращивания тканей и органов для трансплантации. В настоящее время созданы банки стволовых пуповинных и плацентарных клеток. МЗ РФ разрешило клинические испытания клеточных систем в кардиологии и неврологии.

Глава V.