Работа 7. Выделение и количественный учет микроорганизмов почвы на твердых питательных средах

Общее количество микроорганизмов в почве свидетельствует об интенсивности биохимических процессов, протекающих в почве и определяющих накопление элементов корневого питания растений. Количество микроорганизмов в почве определяют методом посева почвенной суспензии на питательные среды либо прямым микроскопическим счетом клеток на препаратах.

Метод посева почвенной суспензии на твердые питательные среды (МПА, КАА, среду Эшби, среду Чапека) позволяет учесть общее количество микроорганизмов и получить на пластинке с агаром изолированные колонии для выделения микроорганизмов в чистую культуру.

Микроорганизмы, выделенные в чистую культуру, в дальнейшем могут быть всесторонне изучены и идентифицированы. В этом прежде всего заключается ценность этого метода. Однако в лабораторной практике микробиологии нет универсальной питательной среды, на которой развивались бы все почвенные микроорганизмы. Даже применение наиболее универсальных питательных сред позволяет учесть лишь незначительную часть микронаселения почвы (0,1—1,0%).

Сущность метода заключается в нанесении почвенной суспензии микроорганизмов на поверхность твердой питательной среды. Количество микроорганизмов определяют по числу развившихся колоний, учитывая, что одна микробная клетка дает начало одной колонии. Таким образом, метод позволяет учесть лишь микроорганизмы, способные развиться на данной питательной среде, результаты же общей численности микроорганизмов получаются заниженные.

Материалы и оборудование

Весы, разновесы, часовое стекло, скальпель, ступка, резиновая перчатка, колба со стерильной дистиллированной водой, пипетки на 10 мл и 1 мл, микропипетки на 0,1 мл, пробирки, колба объемом 250 мл, колба с питательной средой, чашки Петри, стеклянные шпатели.

Ход работы

Приготовление почвенной суспензии Для приготовления разведений почвенной суспензий готовят ряд пробирок с 9 мл стерильной дистиллированной воды, колбу, содержащую 90 мл стерильной воды, и вторую колбу, стерильную, сухую, объемом 250 мл.

Для диспергирования почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с поверхности почвенных частиц почву обрабатывают ультразвуком (установка УЗДН-1, 15 кГц,0,ЗА), растирают или встряхивают на пропеллерной мешалке. Такая предварительная обработка почвы позволяет учесть значительно большее количество микроорганизмов (Мишустин, 1975). Наиболее доступным приемом предварительной обработки почвы, дающим хорошие результаты, считается растирание почвенного образца.

Исследуемую почву высыпают на стерильное стекло. Стекло заранее протирают спиртом и обжигают на пламени. Почву тщательно перемешивают шпателем, удаляя механические частицы и корни растений. Соблюдая стерильность, на часовом стекле отвешивают 10 г. почвы и переносят ее в стерильную ступку.

Навеску почвы в ступке увлажняют до пастообразного состояния, добавляя 2—3 мл воды из первой колбы, содержащей 90 мл стерильной воды, и растирают 5 мин пальцем в резиновой перчатке. После растирания почву из ступки переносят с помощью воды во вторую сухую колбу, получают первое разведение - 1/10.

Почвенную суспензию в колбе встряхивают в течение 5 мин, дают отстояться 30 с и далее стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии из колбы в пробирку ¹ 1 с 9 мл стерильной дистиллированной воды, получают второе разведение—1/100. Подобным образом готовят ряд последующих разведений почвенной суспензии—1/1000, 1/10000, 1/100000 и более в зависимости от предполагаемой численности микроорганизмов, учитывая тип почвы, генетический горизонт, сезон года,

350 колоний 70 колоний 12колоний

Рис. 17. Схема приготовления разведений и высева почвенной суспензии на твердые питательные среды.

влажность почвенной пробы и т.д. Для приготовления каждого нового разведения почвенной суспензии следует пользоваться новой стерильной пипеткой (рис. 17).

Посев. Для выделения и количественного учета бактерий почвенную суспензию высевают на одну из питательных сред МПА, КАА, почвенный агар, среду Эшби; для учета актиномицетов используют КАА или среду Чапека; для выделения и количественного учета грибов и дрожжей применяют СА или модифицированную среду Чапека.

Питательную среду, расплавленную на водяной бане, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри слоем 0,5—0,8 см. Для высева на каждое разведение почвенной суспензии готовят по 3—5 чашек Петри. После застывания среды для удаления капель воды с крышек и появления муаровой поверхности на агаре чашки Петри подсушивают в термостате при температуре 60—70°С. На крышке чашки Петри пишут этикетку, указывая номер почвенной пробы, дату посева, разведение и повторность.

Для выделения почвенных микроорганизмов обычно проводят поверхностный посев почвенной суспензии на питательную среду. Предварительно до посева отбирают пипетки на 1 мл с одинаковым числом капель жидкости, так как размер капель из разных пипеток может отличаться, что приведет к ошибке в подсчете микроорганизмов. На каждое новое разведение почвенной суспензии следует приготовить новую стерильную пипетку и новый стерильный шпатель.

Стерильной пипеткой на 1 мл наносят каплю почвенной суспензии из соответствующего разведения по центру питательной среды в чашке Петри и тщательно растирают ее стеклянным шпателем по всей поверхности агаровой пластинки. Для посева почвенной суспензии удобно пользоваться микропипетками на 0,1—0,2 мл. Засеянные чашки Петри переворачивают средой вверх и помещают в термостат при температуре 28—30°С.

Колонии бактерий на чашках Петри подсчитывают через 3—5 суток, грибов и дрожжей—через 5—7, актиномицетов— через 7—15. Наиболее точный результат получается при развитии на чашке Петри 50—200 колоний бактерий и актиномицетов и 30—50 колоний грибов. Следует иметь в виду, что при очень большом и очень малом количестве колоний на чашках Петри могут быть значительные ошибки при подсчете микроорганизмов. Обычно почвенную суспензию высевают из 3—4 последовательных разведений на 3—5 чашек Петри из каждого разведения. Для учета грибов почвенную суспензию высевают из разведений на 1—2 порядка ниже, чем для учета бактерий и актиномицетов.

Подсчет колоний микроорганизмов на чашках Петри Для удобства подсчета колоний микроорганизмов дно чашки Петри разделяют тушью или чернильной пастой на секторы или сегменты. Если питательная среда прозрачна, колонии подсчитывают в проходящем свете со дна чашки; в случае непрозрачной питательной среды колонии микроорганизмов подсчитывают непосредственно с поверхности агара. Учтенные колонии отмечают точками на стекле. Для подсчета мелких колоний пользуются ручной лупой. Чашки Петри, в которых развилась масса колоний микроорганизмов, обрабатывают специальным прибором для счета микробных колоний, выпускаемым медицинской промышленностью СССР.

Подсчитав число колоний микроорганизмов, развившихся на чашках Петри по всем повторностям соответствующего разведения, определяют средние число колоний на чашке и далее пересчитывают количество микроорганизмов на 1 г. воздушно-сухой почвы по формуле:

а = б´в´г

д

где а— число клеток микроорганизмов в 1 г. воздушно-сухой почвы, б—среднее число колоний микроорганизмов на чашке Петри, в—соответствующее разведение, г—количество капель в 1 мл жидкости в пипетке, д—навеска почвы, взятой для анализа.

Для большей точности учета численности микроорганизмов параллельно микробиологическому анализу определяют процент влажности почвенной пробы и окончательное количество микроорганизмов рассчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы.