Работа 28. Прямой счет микроорганизмов почвы под микроскопом

Метод прямого счета микроорганизмов С. Н. Виноградского и модификации О. Г. Шульгиной позволяет более точно учесть численность микроорганизмов в почве, нежели методы высева почвенной суспензии на агаризованные питательные среды. В свою очередь точный учет численности микроорганизмов в почве дает более полное представление о ее биогенности. Однако следует иметь в виду, что при работе данным методом получаются несколько завышенные результаты, так как на препаратах не удается дифференцировать живые и мертвые клетки микроорганизмов.

Материалы и оборудование

Ступка, резиновая перчатка, спиртовка, часовое стекло, весы, разновесы, скальпель, пинцет, колба, содержащая 45 мл стерильной дистиллированной воды, исследуемая почва, микропипетки на 0,1—0,2 мл, обезжиренные предметные стекла, 5%-ный раствор карболового эритрозина, абсолютный спирт или 2%-ный раствор осмиевой кислоты, микроскоп.

Ход работы

Небольшое количество исследуемой почвы растирают в течение 10 мин в ступке пальцем в резиновой перчатке. На часовом стекле отвешивают 5 г почвы и переносят ее в колбу, содержащую 45 мл стерильной воды, получают разведение 1/10. Если анализируемая почва характеризуется высокой численностью микроорганизмов, готовят следующее разведение. В колбу № 2, содержащую 90 мл стерильной воды, пипеткой приливают 10 мл почвенной суспензии из колбы № 1, получают разведение 1/100.

Содержимое колбы встряхивают в течение 5 мин, затем дают крупным частицам отстояться 3—5 с и стерильной микропипеткой переносят 0,01—0,02 мл почвенной суспензии на обезжиренное предметное стекло, равномерно распределяя ее на площадь 4 см². Квадрат на стекле вычерчивают заранее алмазом, подложив под стекло миллиметровую бумагу.

Приготовленный препарат высушивают на воздухе, фиксируют на пламени либо абсолютным спиртом 5 мин, либо парами 2%-ного раствора осмиевой кислоты 2—4 мин. Далее препарат окрашивают карболовым эритрозином 30—40 мин и более в зависимости от качества красителя. Эритрозин хорошо окрашивает бактериальные клетки и не окрашивает почвенные частицы. Окрашенный препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. Конденсор микроскопа тоже обязательно иммергируют.

Подсчет микроорганизмов ведут в 50—100 полях зрения микроскопа либо в 50—100 квадратах окулярной сетки, если бактерий много. При подсчете отмечают соотношение морфологических форм бактерий.

Расчет количества бактерий в 1 г почвы ведут по формуле:

Ax4x10⁸ xD

X=------------------------

50xBxC

где X — число бактерий в 1 г почвы, А — число бактерий в 50 полях зрения микроскопа, В — площадь поля зрения микроскопа, мкм², С—объем почвенной суспензии, мл, нанесенной на стекло, D—исходное разведение почвенной суспензии.

Площадь поля зрения микроскопа определяют по формуле. Диаметр поля зрения микроскопа вычисляют с помощью окулярного и объективного микрометров. Определив цену деления окулярного микрометра при данном увеличении микроскопа, определяют диаметр поля зрения в микрометрах и рассчитывают площадь поля зрения микроскопа (см. выше).

Пользуясь окулярным и объективным микрометрами, можно определить также площадь квадрата окулярной сетки.

Пример расчета

Если сторона квадрата окулярной сетки равна 0,02 мм, а площадь квадрата—0,0004 мм² (окуляр 10Х, объектив 90Х),тогда на площадь препарата 4 см² приходится 1000 000 таких квадратов окулярной сетки. Допустим, что на один квадрат окулярной сетки в среднем приходится 3,5 бактерии, тогда на площади препарата 4 см² окажется: 3,5 х 1000000 = 3500000 бактериальных клеток. А если учесть, что на препарат наносили 0,01 мл почвенной суспензии, в которой содержится 0,001 г почвы (разведение 1/10), то полученную величину необходимо умножить на 1000, тогда в 1 г исследуемой почвы будет содержаться 3 500 ООО х 1000 = 3500000000 бактериальных клеток. Таким образом, каждая бактерия в квадрате окулярной сетки отвечает 1 млрд. бактерий в 1 г почвы.