Отбор и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений

Для получения трансгенных растений клеточные клоны, отобранные на селективной питательной среде, переносят на регенерационную среду. С целью повышения эффективности отбора трансформантов добавляют селективный агент и в регенерационную среду, а также в питательные среды, применяемые для укоренения растений-регенерантов, их клонального размножения in vitro. Среди высаженных в грунт растений-регенерантов или растений, отобранных на селективных средах после трансформации in planta, выделяют экземпляры с привнесенным признаком (если это можно сделать визуально), выбраковывают те, что имеют выраженные отклонения в росте и развитии (если это не было целью генетической модификации). Далее проводят селекционную оценку трансформантов. В качестве кандидата на новый сорт могут претендовать только трансгенные линии с максимальным проявлением нового признака и минимальным отличием от исходного сорта по остальным признакам.

Предположительно трансгенные растения подлежат молекулярно-генетическому анализу, который позволяет подтвердить факт трансгенной вставки и экспрессии встроенных генов, получить информацию о характере генетической модификации, ее стабильности, отсутствии непреднамеренных изменений при ее переносе в геном растения.

Для доказательства наличия трансгенной вставки в геноме анализируемых растений чаще всего применяют ПЦР-детекцию в их ДНК специфических последовательностей целевого гена или других элементов, представленных в использованной генетической конструкции. Чтобы исключить ложно-положительные результаты, обусловленные наличием в сосудистой системе растений выживших агробактерий, проводят детекцию специфических для них генов, отсутствующих в трансгенной вставке, например гена протеина vir E2 (ПЦР-продукта этого гена не должно быть). Наличие трансгенной вставки можно также подтвердить с помощью блоттинга по Саузерну, используя в качестве зонда фрагмент ДНК целевого гена. Этим методом определяют и количество копий вставки (по числу и размерам способных гибридизоваться с зондом фрагментов ДНК трансгенных линий, подвергнутых рестрикции, при которой один сайт рестрикции располагается в пределах перенесенной последовательности ДНК, а второй сайт за ее пределами в произвольном участке генома растений). С помощью анализа расщепления по целевому и/или селективному гену в потомстве трансгенной линии от самоопыления или от скрещивания с исходным сортом определяют стабильность и характер наследования встроенных генов при половом размножении. Наличие селективного гена у сеянцев выявляют, проращивая семена на селективной среде, или с помощью ПЦР-детекции, целевого гена – с помошью ПЦР-детекции.

Индикатором экспрессии в трансгенном растении встроенных генов является образование соответствующих мРНК. Для их выявления используют метод нозерн-блоттинга (аналогичный Саузерн-блоттингу, отличающийся тем, что изучаемым субстратом является мРНК), а также ОТ-ПЦР. В последнем случае выделяют из анализируемых растений РНК, затем получают кДНК, в которой выявляют последовательности целевого и других встроенных генов с помощью специфичных для них праймеров. Секвенирование кДНК встроенных генов дает возможность определить последовательность нуклеотидов и, с помощью специальной компьютерной программы, последовательность аминокислот их экспрессируемых продуктов. Эта информации имеет важное значение для определения токсического и аллергенного потенциала этих продуктов при оценке биобезопасности полученных ГМО (путем сравнения их строения с данными по аминокислотному составу известных токсинов и аллергенов по международным базам данных).

Экспрессию встроенных генов оценивают также по наличию у них соответствующих белковых продуктов. Для их выявления используют вестерн-блоттинг (зондами являются меченые специфичные к определяемому белку антитела), иммуноферементный анализ (ELISA), другие аналитические методы обнаружения определенных протеинов. Некоторые из этих методов, например ELISA, обеспечивают возможность количественного определения содержания белка в различных органах и тканях. Об экспрессии трансгенов у ГМ-растений во многих случаях можно судить визуально по степени проявления у них привнесенных признаков, например, удлинении сроков созревания, инсектицидной активности и др.

Результаты молекулярно-генетического анализа трансгенных линий являются обязательным и одним из наиболее важных разделов досье ГМО, которое готовят в соответствии с законодательством в области биобезопасности (см. главу 11). В досье среди прочей информации должно быть представлено описание аналитического метода, позволяющего идентифицировать данную трансгенную линию, в том числе в переработанных продуктах питания, сырье и кормах.