Агробактериальная трансформация

Раскрытие природы агробактериальной трансформации по праву считается одним из величайших научных достижений ХХ века, поскольку дало возможность использовать в генетической инженерии уникальный природный механизм горизонтального переноса генов (то есть переноса генов между отдаленными в систематическом отношении видами организмов).

Онкологическое заболевание растений - корончатый галл - издревле известно людям (его упоминание имеется еще в трудах Аристотеля). Этой болезни, имеющей серьезные агрономические последствия из-за нарушения нормального роста растений, подвержены многие двудольные растения: виноград, косточковые фруктовые деревья, розы и др. В начале прошлого века был установлен возбудитель заболевания – почвенные бактерии из рода Agrobacterium: A. tumefaciens (вызывает у растений образование опухоли – корончатого галла), A. rhizogenes (вызывает образование на стебле растений многочисленных корней – hairy root), A. rubi (возбудитель галлов у тростника). Однако только в 1970 годах удалось раскрыть механизм патогенеза. Van Lareke et al. (1974), Zaenen et al. (1974) установили, что у вирулентных штаммов A. tumefaciens в отличие от невирулентных имеется большая плазмида, получившая название Ti (tumor inducing – индуцирующая опухолеобразование) у A. tumefaciens и Ri (root inducing –индуцирующая образование корней) у A. rhizogenes.

В ходе изучения этих плазмид выяснилось, что опухоль возникает в результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т-ДНК, от англ. transferred DNA – переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et al., 1977]. При этом гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов – октопинов и нопалинов при заражении A. tumefaciens или агропинов при заражении A. rhizogenes. Помимо этих соединений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные фитогормоны, резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли. Опины, экскретируемые инфицированными клетками, служат источником азота, углерода и энергии для возбудителей заболевания – агробактерий, поскольку у них на Ti-плазмиде имеются гены, кодирующие ферменты, необходимые для катаболизма этих соединений. Как видим, агробактерии создали для себя весьма уютную экологическую нишу, в которой у них практически нет конкурентов.

Для инициации процесса агробактериальной трансформации необходимо, прежде всего, чтобы растение было повреждено, например, механическим путем при вспашке, прополке и т.п. Пораненные клетки выделяют в окружающую среду различные химические соединения, которые привлекают агробактерии (положительный хемотаксис). Далее бактерии прикрепляются к растениям в месте поранения с помощью целлюлозных фибрилл. Плотный контакт между бактериальной и растительной клетками является одним из важных факторов успешной трансформации. В генетическом контроле описанных начальных этапов агробактериальной трансформации в основном задействованы гены, расположенные на хромосоме бактерии. Их активность определяет все многообразие взаимодействий между бактерией и растением, включая распознавание растения-хозяина (определенные штаммы агробактерий могут трансформировать определенные виды растений) (рисунок 9.8).

Однако в генетическом контроле собственно переноса Т-ДНК главными являются гены, расположенные в vir-области Ti-плазмиды (vir-гены плазмиды). Некоторые хромосомные гены могут влиять на активность плазмидных vir-генов. Плазмидные vir-гены расположены на одном регулоне размером около 40 т.п.н., который расположен отдельно от Т-области. У октопиновых штаммов агробактерий vir-регулон содержит не менее 10 идентифицированных vir-локусов, состоящих из нескольких генов, которые обозначают virА, virВ и т.д. до virJ. У нопалиновых штаммов агробактерий в аналогичном регулоне обнаружено семь локусов.

Активность vir-генов индуцируется сигнальными молекулами химических соединений, выделяемых растениями при поранении: фенольными соединениями типа ацетосирингона и альфа-гидрооксиацетосирингона, предшественниками лигнина, синапиновой кислотой, кониферил алкоголем и др. или некоторыми флавоноидами. Для индукции vir-генов существенным является также наличие кислой среды, легко катаболизируемых источников углерода, например, сахарозы или моносахаридов, температуры ниже 30^оС.

Индуцирующий сигнал соединений, выделяемых растениями при поранении, воспринимается протеинами – продуктами генов virА и virG (signal-transduction complex). Протеин VirА является трансмембранным протеином, который имеет короткий периплазматический связывающий домен (место прикрепления определенных молекул) – N-терминал, который воспринимает сигналы от растительных фенольных соединений, и длинный, цитоплазматический район, так называемый С-терминал. С-терминал обладает автофосфорилирующей активностью и способен активировать путем фосфорилирования протеин VirG. Активированный VirG является протеином, способным связываться с ДНК. Он распознает соответствующие регуляторные последовательности других плазмидных vir–генов и способен активировать их транскрипцию.

Активация экспрессии vir–генов под действием VirG приводит к запуску ряда последовательных взаимосвязанных событий, которые обеспечивают подготовку Т-ДНК к переносу в растительную клетку. Первый этап включает сайт-специфическое вырезание кодирующей нити Т-ДНК протеинами-продуктами генов virD (helicase/endonuclease protein complex). Полипептид VirD2 в присутствии протеина VirD1 распознает специфические последовательности Т-ДНК, состоящие из 25 п.н., расположенные в начале и конце Т-области, и производит вырезание кодирующей нити ДНК. Эти последовательности получили название соответственно левый (LB – left border) и правый (RB – right border) край Т-области. Они играют исключительно важную роль в процессе переноса Т-ДНК из бактериальной клетки в растительную.

Вырезанная кодирующая нить Т-ДНК реплицируется, в результате чего образуется однонитчатая ДНК (ssDNA – single-stranded DNA), получившая название Т-нить. Точно известно, что именно такая однонитчатая Т-ДНК переносится в растительную клетку. После вырезания Т-ДНК VirD2 остается ковалентно связанным с ее 5’-концом и действует как направляющий протеин при ее движении из бактериальной клетки в растительную, а также предохраняет 5’-конец от действия эндонуклеаз.

Перенос Т-ДНК через мембраны бактериальной клетки происходит при участии 11 протеинов-продуктов генов virВ (VirB1-11), а также VirD4. Они образуют транспортный комплекс секреторной системы IV типа (T4SS). Секреторная система IV типа имеется у многих грам-отрицательных бактерий, она служит для конъюгативного переноса плазмид между бактериями, а также для перемещения факторов вирулетности от патогенов к клеткам хозяина во время инфекции. Названные протеины формируют так называемый трансмембранный поровый комплекс, который устанавливает связь между наружной и внутренней мембранами бактериальной клетки, и через который происходит перемещение Т-комплекса. Протеины VirB4 и VirB11 являются связанными с мембранами АТФазами, что говорит о том, что процесс переноса Т-комплекса является активным и он осуществляется с затратой энергии. Каким образом Т-ДНК далее проникает в растительную клетку точно не установлено. Предполагается, что в этом процессе могут участвовать бактериальные пили, которые могут выполнять роль полой иглы: протыкать оболочку и мембрану растительной клетки, а Т-ДНК по их каналу попадает в цитоплазму. Внутрь растительной клетки поступают и другие макромолекулы, в частности Vir E2, Vir E3, VirF, VirD5, необходимые для доставки Т-ДНК к ядру хозяйской клетки и включения в ее геном.

В растительной клетке VirE2 плотно покрывает Т-нить по всей ее длине (образуется зрелый Т-комплекс, имеющий спиралеобразную структуру), предохраняя ее от деградации эндонуклеазами. Этот комплекс из-за относительно больших размеров не может попасть в ядро растительной клетки с помощью диффузии. Его доставка осуществляется с помощью бактериальных протеинов, выполняющих роль эффекторов вирулентности, которые, взаимодействуя со специфическими белками и системами растительной клетки, способствуют перемещению Т-комплекса к ядру, хроматину и встраиванию Т-ДНК в геном растительной клетки. Предполагается, что перемещение Т-комплекса к ядру происходит вдоль микротрубочек с помощью двигательных протеинов типа DLC3 (dynein-like protein). Этот процесс, а также преодоление пор ядра (их диаметр 9 нм меньше диаметра Т-комплекса 15 нм) являются активными, с затратой энергии. Установлено, что VirE2 взаимодействует со специфическим растительным белком защитного ответа растения на инфекцию VIP1. Его фосфорилирование в случае инфекции сопровождается переносом в ядро, где он активирует связанный с патогенезом (patogenesis related) ген PR1, а также другие гены ответа на стресс (то есть является транскрипционным фактором). Благодаря тому, что VIP1 в силу своей функциональной ответственности взаимодействует с хроматином растительной клетки, тем самым в область хроматина доставляется и связанный с ним Т-комплекс. Для видов растений, у которых вырабатывается небольшое количество VIP1, его функцию в агробактериальной трансформации может выполнять бактериальный белок Vir E3. Проникновению Т-комплекса в ядро также способствует наличие у него белка VirD2. VirD2 в случае его синтеза в эукариотических клетках является ядерным белком, который непосредственно взаимодействует с импортином-альфа, являющимся элементом ядерного транспорта.

Интеграция Т-ДНК в геном растения завершает процесс ее переноса. Анализ последовательностей ДНК вокруг места вставки показал, что этот процесс не является сайт-специфичным, и не требует высокой степени гомологии (негомологичная рекомбинация). Встраивание Т-ДНК не происходит в строго определенные места (сайты) растительного генома, а в значительной степени случайно. Тем не менее, отмечено, что вставки чаще оказываются в области транскрипционно активного хроматина, в частности вблизи теломер хромосом растений. Обычно встраивается одна или несколько копий Т-ДНК в одном или нескольких местах растительного генома. Нередко интеграция Т-ДНК в геном не происходит вообще.

Т-ДНК встраивается в основном в местах двунитевых разрывов с участием ферментов ДНК-репарации растительной клетки. Перед встраиванием Т-ДНК освобождается от защитного покрытия VirE2 (в этом процессе принимает участие убиквитин-протеосомная система (UPS – ubiquitin-proteasome system) растительной клетки, в состав которой включается бактериальный F-box протеин VirF, а протеин VirD5 предохраняет ее от деградации) и происходит дупликация комплементарной нити Т-ДНК (т.е. она превращается в двунитевую ДНК). При этом возможно соединение двух и более Т-ДНК, причем разными концами [Lacroix et al. 2011].

Таким образом, агробактерии для осуществления трансформации не только приспособили свою секреторную систему (с целью переноса Т-ДНК в растительную клетку), но также используют систему защиты растительной клетки от инфекции (для перемещения Т-ДНК в ядро и контакта с хроматином) и систему репарации ее ДНК (для интеграции ДНК в геном).

В случае, если встраивание Т-ДНК прошло без осложнений, гены, расположенные на ней, стабильно экспрессируются. Так называемые onc-гены (онкогены) определяют сверхпродукцию фитогормонов ауксина индолилуксусной кислоты и цитокининов, что вызывает неконтролируемый рост и деление трансформированных клеток. В результате образуется корончатый галл. Как отмечалось выше (раздел 3.4), клетки корончатого галла способны расти в культуре in vitro на питательной среде без фитогормонов, поскольку они в состоянии обеспечить ими себя самостоятельно. Активность другой группы генов, расположенных на Т-ДНК, связана с образованием опухолеспецифичных метаболитов – опинов (октопинов, нопалинов, агропинов).

Как видно из представленного описания агробактериальной трансформации, ни онкогены, ни гены, кодирующие образование опинов, в самом процессе переноса Т-ДНК из агробактерии в клетку растений никакой активной роли не выполняют. В этом процессе существенную роль играет лишь крайне незначительная часть Т-ДНК, представленная левым и правым краями из 25 п.н. Если удалить ту часть Т-ДНК, которая расположена между ее краями, и встроить туда нужные гены с соответствующими регуляторными элементами, то они могут быть перенесены и встроены в геном растения с помощью агробактерии точно так же, как она это делает со своими собственными генами. Именно на этом принципе построено использование агробактериальной трансформации в генетической инженерии растений.

Сis- или коинтегративные вектора получают путем вставки нужных генов в Т-область Ti-плазмиды Agrobacterium с помощью гомологичной рекомбинации. Trans- или бинарные вектора не имеют гомологии с Т-ДНК. Конструируют их исключительно методами технологии рекомбинантных ДНК, описанными выше (встраивание нужных фрагментов ДНК между левым и правым краями осуществляют с помощью полилинкеров). Они обязательно содержат сайт начала репликации (ori) от плазмиды с широким кругом хозяев, либо содержат ori-сайты как Agrobacterium, так и E. coli, благодаря чему способны автономно реплицироваться в обоих этих микроорганизмах (рисунок 9.9).

При создании современных трансгенных сортов растений в основном используют бинарные векторные системы. После клонирования в E. coli, изучения и отбора нужных конструкций генов, отобранные бинарные вектора переносят в специальные штаммы Agrobacterium. Их создают на основе высоко вирулентных штаммов Agrobacterium (как правило, A. tumefaciens). Характерной особенностью этих штаммов является то, что они имеют так называемую разоруженную (disarmed) или хэлперную (helper) vir-плазмиду. Последняя представляет собой Ti-плазмиду, которая содержит интактную vir-область, но у которой полностью удалена Т-область. Привнесенный в Agrobacterium бинарный вектор способен в ней автономно реплицироваться благодаря наличию ori-сайта от плазмиды с широким кругом хозяев. Благодаря же наличию разоруженной vir-плазмиды он может успешно переноситься и встраиваться в геном клеток растений.

Как видим, при разработке бинарных векторных систем использована такая важнейшая особенность механизма агробактериальной трансформации, согласно которой vir-область Ti-плазмиды лишь обеспечивает перенос Т-ДНК из бактерий в растения, но сама при этом в растения не попадает. С другой стороны, в процессе переноса Т-ДНК существенным является лишь присутствие очень небольшой ее части по 25 п.н. ее левого и правого края. Остальная часть Т-области, в том числе все онкогены, и гены, кодирующие образование опинов, для процесса переноса Т-ДНК являются несущественными. Они выполняют в нем пассивную роль и могут быть безболезненно заменены любыми другими генами.

В бинарных векторных системах, в отличие от естественных штаммов Agrobacterium, основные участники процесса агробактериальной трансформации: vir- и chv-гены, которые обеспечивают перенос Т-ДНК, и переносимая Т-ДНК (точнее ее левый и правый край со встроенными между ними нужными генами), разделены физически. Сhv-гены расположены на бактериальной хромосоме, а vir-гены и Т-ДНК расположены на разных плазмидах. Это очень удобно для целей генетических манипуляций с бинарным вектором, существенно увеличивает его емкость.

С целью осуществления агробактериальной трансформации растений применяют два основных подхода: кокультивирование суспензии агробактерий с различными эксплантатами (листовыми дисками, эмбриоидами, стеблевыми черенками и др.) или суспензией клеток и трансформацию in planta. Кокультивирование проводят в течение определенного срока (от нескольких часов до нескольких суток), затем эксплантаты или клеточную суспензию переносят на питательную среду, в которую добавляют антибиотики, необходимые для подавления бактерий. После освобождения от бактериальной инфекции проводят отбор трансформированных клеток на селективной среде (если это предусмотрено протоколом), затем из каллюса регенерируют растения. Кокультивирование –основной метод получения трансгенных растений: большинство из них получено с его помощью.

Трансформация in planta предполагает инокуляцию суспензией агробактерий семян или различных органов растений. Семена с подвергнутых воздействию агробактерий растений (или выращенных из семян, обработанных агрбактериями), проращивают на селективной среде и отбирают трансформанты. Простейший способ трансформации in planta – замачивание семян в суспензии агробактерий. Для повышения эффективности процесса семена подвергают воздействию ультразвуком, делают на них насечки скальпелем, используют вакуумную инфильтрацию, применяют пункцию агробактерий с помощью шприца и тонкой иглы. Также инокулируют агробактериями стеблевые меристемы, цветочные почки. Хорошие результаты были получены при проведении трансформации in planta во время процесса оплодотворения (агробактериями инокулируют пестики и/или пыльцу). Считается, что пыльцевые трубки во время их роста в пестиках являются наиболее чувствительными мишенями для агробактерий.

Безусловно, агробактериальная трансформация – наиболее эффективная технология введения трансгенов в клетки растений. Однако она имеет ограничения, связанные с кругом хозяев агробактерий. Многие двудольные и голосеменные и практически все однодольные растения являются устойчивыми к агробактериям и никогда не образуют опухолей. Для многих однодольных растений, особенно злаковых, характерна пониженная регенерационная способность из каллюса. Однако благодаря оптимизации технологии в лабораторных условиях стала возможной агробактериальная трансформация широкого круга высших растений, а также грибов и даже животных клеток. В частности, разработаны протоколы агробактериальной трансформации риса [Hiei et al., 1994], кукурузы [Ishida et al., 1996], пшеницы [Cheng et al., 1997] и других злаковых культур.

Благодаря расшифровке основных механизмов процесса, изучению факторов, которые могут оказывать на него влияние, удалось существенно повысить эффективность агробактериальной трансформации. Были отобраны высоковирулентные штаммы агробактерий, на основе которых созданы эффективные бинарные векторы. Появились так называемые супербинарные векторы, которые обладают повышенной вирулентностью благодаря добавке дополнительной хелперной плазмиды с отдельными vir–генами. Разработаны методы нанесения на эксплантаты большого количества очень мелких повреждений с помощью ультразвука или бомбардировкой микрочастицами, что обеспечивает увеличение количества мест контакта агробактерий с растительными клетками. Добавка в питательную среду для суспензии агробактерий ацетосирингона и других веществ, активирующих vir–гены, сделало рутинным применение метода для культур, которые в природе являются устойчивыми к агробактериям. Хорошие результаты были получены при использовании антиоксидантов цистеина, нитрата серебра, аскорбиновой кислоты и других, которые уменьшают неблагоприятные для трансформации эффекты защитных реакций растений на инфекцию агробактериями. Существенно повысить эффективность трансформации в каждом конкретном случае позволяет оптимизация таких факторов, как сочетание генотипов агробактерии и растения, температура, состав среды для инокуляции, продолжительность кокультивирования, питательные среды и условия культивирования трансформированных клеток, регенерации растений.