Экспрессия трансгенов

Экспрессия трансгенов у высших растений может происходить без вставки (транзиентная экспрессия) и после вставки в геном растительной клетки (стабильная экспрессия). Транзиентная экспрессия имеет место непосредственно после проведения агробактериальной трансформации: в течение 2-4 дней после нее наблюдают пик активности трансгенов, которая постепенно падает (уменьшается как число экспрессирующих трансгены клеток, так и уровень экспрессии на клетку). Явление транзиентной экспрессии нашло применение в молекулярно-генетических исследованиях для быстрой доставки в клетки определенных белковых продуктов. В частности, наиболее точный метод детекции в растениях генов вертикальной устойчивости к болезням и вредителям (R-генов) включает агробактериальную инфильтрацию с определенными генами авирулентности патогена. Экспрессия в растениях этих генов приводит к образованию эффекторов, которые, взаимодействуя с продуктами комплементарных R-генов, вызывают характерную реакцию сверхчувствительности (программируемой клеточной смерти), которую можно через короткое время наблюдать визуально [Vleeshouwers et al. 2011].

Стабильная экспрессия трансгенов появляется через 10-14 дней после трансформации. Она может сохраняться на высоком уровне в течение длительного времени и передаваться потомству. Для целей селекции трансгенных сортов растений стабильное проявление привнесенного признака является одним из наиболее важных. Добиться его во многих случаях весьма сложно. Многие из полученных трансформантов несмотря на наличие подтвержденного факта трансгенной вставки этим признаком не обладают (отсутствует экспрессия трансгенов), или обладают в недостаточной мере (слабая экспрессия), или постепенно его теряют, он не сохраняется при размножении (замолкание трансгенов или утрата вставки).

Существует достаточно много факторов, которые могут оказывать влияние на стабильность экспрессии трансгенов. Прежде всего, это естественные механизмы защитной реакции растения на внедрение чужеродного генетического материала, которые могут проявляться в гибели трансформированных клеток, внутригеномных перестройках, активации РНК-индуцированного комплекса замолкания генов, метилировании привнесенных участков ДНК. Учитывать их и каким-либо образом оказывать на них влияние сложно.

Вместе с тем имеется ряд факторов, существенно снижающих степень экспрессии трансгенов, которые непосредственно связаны с процессом генетической модификации, благодаря чему их можно минимизировать. В частности, известно, что экспрессия трансгенов снижается при вставке очень больших фрагментов ДНК, в случае встраивания нескольких копий вставки, при значительных перестройках встроенной ДНК (делециях, появлении инвертированных повторов), что сравнительно часто наблюдается при использовании таких методов переноса трансгенов в геном растений, как биолистика. В связи с этим в селекции трансгенных сортов стараются использовать, насколько это возможно, наиболее эффективный и предсказуемый метод агробактериальной трансформации. Большое внимание уделяют оптимизации состава трансгенной вставки. В частности, предпочтение отдается модифицированным генам и регуляторным элементам, что обеспечивает более высокую стабильность и высокий уровень экспрессии трансгенов в растениях. Например, вместо полноразмерных нативных генов используют их укороченные версии, кодирующие только активную часть протеина.

С помощью технологии рекомбинантных ДНК удается существенно повысить эффективность существующих промоторов за счет присоединения к ним различных регуляторных элементов, усиливающих экспрессию стоящих под ними генов. В качестве примера можно привести химерную регуляторную последовательность, использованную в толерантной к гербициду глифосату трансгенной сое MON 89788 для экспрессии гена фермента EPSPS, которая включает: промотор гена tsf1 фактора элонгации EF1 Arabidopsis thaliana, энхансер промотора FVM (вируса мозаики норичника), лидерную последовательность и интрон гена tsf1 A. thaliana, последовательность хлоропластного транзитного пептида. Для усиления экспрессии целевого признака также используют усиленные промоторы, составленные из несколько копий промоторов.

Промоторы целевого и селективного гена в трансгенных конструкциях могут взаимодействовать между собой, если они близко расположены. Это может привести к непредсказуемой и нестабильной экспрессии соответствующих генов. То же может случиться, если вставка трансгена произойдет вблизи промоторной области какого-либо гена растений. В связи с этим при создании трансгенных конструкций рекомендуют ориентировать целевой и селективный ген таким образом, чтобы их промоторы были максимально удалены друг от друга, или между ними помещают какую-либо нейтральную последовательность – спэйсер. Также для этой цели можно использовать для селективных генов такой промотор, как tCUP (конститутивный криптический промотор табака), который не взаимодействует с другими промоторами.

Экспрессия трансгенов в значительной степени зависит от их первичной структуры. Как отмечалось выше (раздел 9.3.1), в генетической инженерии в качестве целевых часто используют прокариотические гены, которые могут существенно отличаться по нуклеотидному составу от эукариотических генов. В ДНК бактерий относительное содержание A+T, как правило, выше, чем у растений. В то же время высокое содержание А+Т характерно для сайтов полиаденилирования и других терминальных последовательностей, сайтов сплайсинга, сигналов деградации мРНК эукариот. По частоте использования кодонов бактериальные гены также значительно отличаются от генов растений. Так, в растениях редко встречаются сочетания динуклеотидов CG и TA в позициях «2» и «3» кодонов, а также нуклеотид G в позиции «3» кодонов, кодирующих треонин, пролин, аланин и серин. Проанализировав сиквенс предполагаемых целевых генов с помощью специальных компьютерных программ, можно выявить перечисленные нежелательные в растениях кодоны. После этого производят генно-инженерными методами замену в них нуклеотидов, получая синонимичные кодоны (то есть кодоны одних и тех же аминокислот), характерные для растительных генов. С помощью этой методики удалось, в частности, существенно повысить экспрессию в растениях генов инсектицидных протеинов Bacillus thuringiensis [Adang et al. 1993].

Важным фактором, который может существенно влиять на активность привнесенных генов, является случайный характер вставки трансгенов в геном растений. В зависимости от места встраивания степень экспрессии трансгенов может различаться в тысячи раз: от полного молчания до активной стабильной экспрессии. Это явление получило название «эффект положения» трансгена («gene position effect»). Чтобы минимизировать эффект положения вставки, получают большое количество первичных трансформантов, среди которых в дальнейшем отбирают генотипы с требуемым уровнем экспрессии трансгенов. Решить эту проблему можно и с помощью генно-инженерных подходов: путем введения в трансгенные конструкции так называемых MARs (matrix attached regions) – специальных последовательностей, которые предположительно обеспечивают повышенную экспрессию расположенных рядом с ними генов за счет изменения конфигурации петель ДНК относительно ядерного матрикса (гены, расположенные на малых петлях ДНК, экспрессируются сильнее, чем те, что располагаются на больших петлях) [Mlynarova, Nap, 1997]. Следует, однако, иметь в виду, что последовательности MARs, так же как и селективные гены с их регуляторными элементами, не являются в трансгенных конструкциях обязательными элементами, необходимыми для проявления привнесенного признака, что делает их использование нежелательным.