Методы переноса генов в живые клетки

Выше в общих чертах была описана методика введения рекомбинантных плазмид в клетки бактерий E. сoli для клонирования генов. Однако клетки растений существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать чужеродную ДНК. Прежде всего, растительные клетки имеют жесткие целлюлозные оболочки, преодолеть которые весьма непросто. Поэтому для их трансформации используют специфические методы. С целью же обеспечения возможности применения обычных для микроорганизмов и животных клеток методов разработаны эффективные методы трансформации протопластов растительных клеток.

Для трансформации растительных протопластов применяют хорошо известные по бактериям методы стимуляции этого процесса с помощью CaCl₂, а также полиэтиленгликоля. Очень эффективным методом оказалась и электропорация. Весьма перспективной рассматривается методика введения чужеродной ДНК в протопласты с помощью микроинъекций. Созданы компьютерные системы на основе соединенных с инвертированным микроскопом микроманипуляторов, обеспечивающие обнаружение, прикрепление и перемещение отдельных протопластов и микрокапилляров, через которые вводят ДНК в клетку. Однако главная проблема в трансформации протопластов растений – возможность использовать эту технологию лишь для ограниченного числа видов, для которых разработаны эффективные методы выделения, культивирования протопластов и получения из них растений-регенерантов.

Среди методов прямого переноса генов в растительные клетки наибольшее распространение получил метод биологической баллистики (биолистики), или как его еще называют, бомбардировки частицами (particle bombardment), генного дробовика (gene gun technique) [Sanford et al., 1987; Klein et al., 1987]. Суть метода заключается в том, что на частицы диаметром 0,4-1,7 мкм из вольфрама или золота напыляют рекомбинантные ДНК, содержащие предназначенные для переноса гены с необходимыми регуляторными элементами. Эти частицы разгоняют до скорости 300–600 м/сек в специальном пневматическом аппарате («генной пушке») и помещают на их пути растительные ткани (меристемы, незрелые зародыши, колеоптили, протокормы, пыльцу) или культуры клеток (каллюс или суспензию клеток). В результате частицы проникают в клетки, а чужеродная ДНК встраивается в ДНК хромосом или органелл (рисунок 9.7). Несмотря на ряд недостатков (нежелательная для трансформации растений многокопийность вставок, разрушение части вносимых генных конструкций и др.), метод биолистики является основным для получения трансгенных однодольных растений, среди которых все злаковые культуры, а также многих двудольных растений, которые являются некомпетентными или слабо компетентными для основного метода введения генов в растительные клетки – агробактериальной трансформации.