Регуляторные элементы

Каждый ген имеет сложную систему регуляции своей активности, в отсутствие которой он не может функционировать. В частности, для транскрипции гена обязательно наличие, помимо кодирующей области, также промотора и терминальной последовательности (терминатора). Промоторы содержат специфические последовательности ДНК, включающие СААТ- и ТАТА-боксы, к которым присоединяется РНК-полимераза II, после чего начинается процесс транскрипции. Терминаторы содержат последовательности сигнала терминации транскрипции (у эукариот это обычно ГЦ-богатые последовательности), а также расположенной приблизительно на 30 п.н. выше последовательности сигнала полиаденилирования ААТАА, которая обеспечивает присоединение к мРНК полиА-хвоста. Считается, что присоединение к 3’-концу мРНК по окончании транскрипции многочисленных остатков аденина (полиА-хвоста) способствуют стабильности мРНК. В придачу к этим обязательным элементам генетические конструкции могут содержать также другие регуляторные элементы, определяющие, например, место и время активности переносимого гена.

Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эукариотического, только в прокариотическом организме (у бактерий, сине-зеленых водорослей). В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений к другому можно использовать гены с их собственными промоторами (что характерно для цис-генеза или интра-генеза). Но если в растение переносится бактериальный ген, то промотор у него должен быть заменен на растительный. На практике и для растительных генов используют промоторы других генов, чтобы повысить их экспрессию или обеспечить их экспрессию в определенных органах растения или в определенный период онтогенеза.

В генетической инженерии растении широкое применение нашли промоторы от растительных вирусов, в частности, промотор CaMV35S вируса мозаики цветной капусты, промотор FVM35S вируса мозаики норичника (Scrofularia ssp.). В процессе эволюции вирусы получили очень сильные промоторы, способные функционировать в любом генетическом окружении. Это свойство вирусных промоторов очень ценно, поскольку обеспечивает активную экспрессию привнесенного трансгена во всех клетках растения на протяжении всего онтогенеза. Такие промоторы называют конститутивными. Наличие сильного конститутивного промотора особенно важно для селективных маркерных генов, поскольку селективная процедура применяется как на клеточном уровне после проведения трансформации, так и на этапе регенерации и укоренения растений-регенерантов. Кроме того, ПЦР-детекция маркерного гена может быть эффективно использована для подтверждения инсерции трансгенов на организменном уровне, для анализа характера расщепления по привнесенным генам в половых поколениях трансформантов (см. ниже).

Безусловным лидером по частоте использования в генно-инженерных исследованиях является промотор CaMV35S малой субъединицы вируса мозаики цветной капусты (общепринятая аббревиатура 35S-промотор). Среди часто используемых в генетической инженерии конститутивных промоторов также промотор гена nos нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (он немного слабее 35S-промотора). Эти промоторы пригодны для широкого круга видов двудольных растений. Для злаковых культур более эффективными конститутивными промоторами являются промоторы генов ract1 актина риса и ZmUbi убиквитина кукурузы.

Если исследователь ставит более сложные задачи в плане регулирования активности трансгенов, то в его распоряжении имеется в настоящее время достаточно широкий выбор промоторов и других регуляторных элементов, комбинирование которых позволяет достичь тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях растения) и времени (в определенный период развития). В качестве примеров тканеспецифических промоторов можно назвать: промотор PSsuAra из Arabidopsis thaliana, который обеспечивает экспрессию находящихся под ним трансгенов исключительно в зеленых тканях (листьях, стебле); промотор PTA29 из табака Nicotiana tabacum – в пыльниках, промотор гена gbss картофеля – в клубнях. Промотор гена rbsS малой субъединицы рибулезобифосфат карбоксилазы-оксигеназы Arabidopsis thaliana – светочувствительный: экспрессия расположенных под ним трансгенов на свету (например, в листьях) в сто и более раз выше, чем в темноте (например, в корнях, клубнях).

В качестве терминаторов в трансгенных конструкциях часто используют терминальные последовательности генов nos Agrobacterium tumefaciens и CaMV35S малой субъединицы вируса мозаики цветной капусты, различных растительных генов (pinII ингибитора протеиназы картофеля, tahsp 17 белка теплового шока пшеницы, rbcS малой субъединицы фермента рибулезобифосфат карбоксилазы гороха, sphas1 запасного белка сои конглицина, phas запасного белка фасоли фазеолина и др.), а также нативные терминальные последовательности переносимых растительных генов.

Кроме названных регуляторных элементов в генетических конструкциях могут присутствовать и другие специальные последовательности. Так, для того, чтобы обеспечить эффективное включение протеинов-продуктов трансгенов в метаболизм клетки, трансгенные конструкции могут содержать, например, последовательности, кодирующие образование транзитного пептида, обеспечивающего доставку трансгенного фермента EPSPS к хлорапластам – месту синтеза ароматических аминокислот (генно-инженерная соя, устойчивая к гербициду глифосату).

Таким образом, для успешного переноса и стабильной, адресной экспрессии в организме-хозяине трансгенные конструкции должны иметь определенный набор кодирующих повторностей и соответствующих регуляторных генетических элементов. В качестве примера типичной трансгенной конструкции можно привести ту, что была использована при получении сортов рапса с системой мужской стерильности/восстановления фертильности, позволяющей получать гетерозисные гибридные семена (Таблица 9.2). Между левым и правым краем от A. tumefaciens, (которые, как известно, играют ключевую роль в переносе Т-области из агробактерии в растительную клетку, см ниже 9.5) в этой конструкции расположены два гена со своими собственными регуляторными элементами: ген целевого признака – мужской стерильности barnase и селективный маркерный ген bar толерантности к гербициду глюфозинату аммония (фосфинотрицину). Отдельные фрагменты ДНК соединены между собой с помощью синтетических полилинкеров.

Интересно, что ген bar толерантности к гербициду глюфозинату аммония играет в этой конструкции тройную роль. Во-первых, он обеспечивает эффективную селекцию трансформированных клеток. Во-вторых, толерантность к гербициду – сам по себе важный агрономический признак. В-третьих, этот ген необходим в системе производства гибридных семян для целей размножения родительских линий.