Детекция ГМ-компонентов в продуктах питания и кормах

Учитывая право потребителей на получение информации о продуктах питания, в том числе о том, что продукт содержит генетически модифицированные составляющие (далее - ГМС), во многих странах принята система соответствующей маркировки. В частности, в Беларуси норма о маркировке ГМО закреплена в Законе «О качестве и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов для жизни и здоровья человека» и Законе «О защите прав потребителей». В соответствии с законодательством при гигиенической регистрации ряд видов продовольственного сырья и продуктов питания (определенных утвержденным правительством перечнем), которые могут вырабатываться их трансгенных растений, подлежит обязательному лабораторному исследованию на наличие ГМС. Для проведения таких анализов создана сеть аккредитованных лабораторий.

Присутствие ГМС в анализируемых образцах можно обнаружить путем выявления в них белковых продуктов определенных трансгенов или повторностей ДНК, характерных для ГМО. Первый из названных подходов, основанный на применении ELISA, на практике практически не используется из-за ряда ограничений. Разработаны стандартные методики лишь для ограниченного числа трансгенных белков (CP4 EPSPS, некоторых инсектицидных протеинов). Метод не позволяет идентифицировать конкретные трансгенные линии. Многие белки в процессе переработки сырья разрушаются. Чувствительность этого метода ниже, чем у методов, основанных на анализе ДНК.

Для детекции ГМС в растительном сырье, пищевых продуктах и кормах в основном используют различные методы ПЦР-анализа. Разработаны и приняты следующие стандартые методики детекции ГМС. Наиболее простой и дешевый метод включает выделение ДНК из анализируемого образца, проведение ПЦР со специфическими праймерами, проведение электрофореза продуктов амплификации. Чувствительность этого метода – около 0,1% ГМС (рисунок 9. ). Второй метод основан на детекции ГМС с помощью иммобилизованных на биочипах специфических ДНК-зондов. Его чувствительность приблизительно такая же, как и у первого из названных методов. Третий метод, ПЦР в реальном времени, наиболее автоматизирован и обладает наиболее высокой чувствительностью (около 0,01% ГМС). Он обеспечивает не только детекцию ГМС, но и их количественное определение. Его недостатком является высокая стоимость оборудования и реактивов.

В зависимости от особенностей национального законодательства по маркировке ГМО применяют два основных направления детекции ГМС: 1) скрининговые исследования; 2) идентификация отдельных трансгенных линий (в англоязычной литературе используется термин transgenic event –трансгенное событие, которое характеризуется генетической конструкцией вставки, видом растения, местом и количеством копий вставки) и количественное определение их содержания в образце. При проведении скрининговых исследований рекомендуются использовать праймеры к генетическим элементам, широко используемым при создании ГМО: к 35S промотору, к терминальной последовательности NOS, маркерному гену npt II. В случае применения в скрининговых исследованиях биочипов помимо названных генетических элементов также выявляют маркерный ген gus и промотор гена ocs (МУК 4.2 2304-07, приложение к Постановлению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30 ноября 2007 г №80). Для идентификации отдельных трансгенных линий используют специфические для них праймеры, которые обеспечивают при проведении ПЦР амплификацию фрагментов ДНК, включающих ДНК вставки и прилегающие к вставке последовательности геномной ДНК растения. При проведении таких исследований с целью сужения поля поиска могут применяться праймеры, позволяющие детектировать определенные целевые гены или генетические конструкции (например, амплификация ДНК, расположенной между определенным целевым геном и определенным промотором). Для проверки качества выделяемых из исследуемых образцов препаратов ДНК применяются методы идентификации последовательностей ДНК, характерных для растений, например, гена лектина сои или гена зеина кукурузы.

При проведении скрининговых исследований анализируют большое количество образцов каких-либо продуктов, которые с определенной вероятностью могут содержать ГМС. Такая система принята, например, в Беларуси, где подлежат обязательному анализу на ГМС продукты из сои и кукурузы, включенные в утвержденный перечень (таблица 9. ). Выбор продуктов сделан на основании анализа посевных площадей, занятых в мире под трансгенными культурами, а также по результатам мониторинговых исследований продуктов, представленных на рынке. Анализ наличия у допущенных к использованию трансгенных линий сои и кукурузы генетических элементов, рекомендуемых для выявления при проведении скрининговых исследований, показал, что 35S промотор вируса мозаики цветной капусты содержат 11 из 17 линий сои и 48 из 54 линий и гибридов кукурузы (по состоянию на ноябрь 2013 г). Остальные рекомендуемые генетические элементы (терминатор NOS,маркерные гены npt II и ген gus, промотор гена ocs представлены лишь у небольшого количества линий. Таким образом, методы детекции ГМС, основанные на выявлении в анализируемых образцах последовательностей ДНК 35S-промотора, позволяют охватить большинство ГМ-продуктов, поступающих на рынок Беларуси. Принимая во внимание, что маркировка ГМС не связана с их биобезопасностью, а проводится исключительно в целях информирования населения, детекция ГМС только по 35S-промотору позволяет сэкономить значительные средства без существенного снижения качества исследований. В отдельных случаях, например при анализе образцов детского питания, содержащих кукурузу, для детекции трансгенной линии GA-21, у которой отсутствует 35S-промотор, целесообразно использовать праймеры, специфичные для этой линии.

Законодательством Европейского Союза и Российской Федерации установлен минимальный порог 0,9% на присутствие в сырье, продуктах и кормах биологического материала зарегистрированных трансгенных линий относительно аналогов традиционной селекции (немодифицированных), превышение которого требует обязательной маркировки соответствующих продуктов, сырья и кормов. Введение названного порога объясняют тем, что технически во многих случаях сложно избежать случайного занесения ГМ-примесей в готовую продукцию при ее производстве, транспортировке и торговом обороте. Идентификация трансгенной линии (события) в образце позволяет предупредить помещение на рынок неавторизованных ГМО. Следует также иметь в виду, что корректное количественное определение содержания ГМС возможно только в случае точной идентификации трансгенной линии.

Количественный анализ содержания ГМС проводят с помощью метода ПЦР в реальном времени на специальных термоциклерах, позволяющих учитывать нарастание флюоресценции, происходящее в ходе амплификации определенных детектируемых фрагментов ДНК со специфическими праймерами и мечеными флюоресцентными красителями зондами. В анализируемых образцах с помощью мультиплексной ПЦР (то есть одновременной ПЦР с несколькими праймерами и зондами) определяют нарастание флюоресценции по детектируемому специфическому для трансгенной линии фрагменту ДНК и фрагменту видоспецифической эндогенной ДНК растения (эндогенный контроль), например гена лектина (при анализе трансгенных линий сои). Зонды, специфичные к трансгену и эндогенному контролю метят разными красителями, например, FAM и VIC. На основании полученных кривых (рисунок 9. ) для каждого образца определяют величину порогового цикла, при котором кривая флюоресценции переходит в экспоненциальную фазу (Ct) по зонду трансгена и по зонду эндогенного контроля, затем рассчитывают разность между ними (dCt). Определение dCt позволяет нормализовать содержание трансгенной ДНК в каждой пробирке относительно ДНК эндогенного контроля.

Одновременно проводят аналогичный анализ ряда референсных (сертифицированных) материалов определенной трансгенной линии с разным фиксированным содержанием ГМС, например, 0,1%, 1,0%, 2,0%, 5,0%. Чаще всего используют материалы производства Института референсных материалов Европейского Союза – Institute for reference materials and measurements JRC, Directorate-General EC. Референсные материалы готовят путем перемешивания биологического материала (например, муки) немодифицированного аналога (0% ГМС) с определенным количеством материала трансгенной линии (100% ГМС). На основании анализа референсных материалов строят калибровочную кривую, используя которую определяют содержание ГМС в анализируемых образцах. Количественное определение ГМС осуществляется с помощью специальных компьютерных программ.