Получение транспластомных растений

В живой клетке высших организмов ДНК содержится не только в ядре, но и в органеллах: пластидах (хлоропластах, хромопластах, лейкопластах и др.) и митохондриях. Изучение организации геномов пластид и митохондрий выявило большое их сходство с бактериальными геномами. Это сходство касается структуры кольцевых молекул ДНК, порядка генов и особенностей их организации в полицистроны, параметров белоксинтезирующей системы, чувствительности органелл к антибиотикам и др. Эти данные подтверждают симбиотическую гипотезу возникновения эукариотических клеток, согласно которой предшественниками органелл являются прокариотические организмы.

Метод биолистики позволяет вводить чужеродную ДНК в клетки, в результате чего может происходить трансформация ДНК органелл. Именно разработка метода биолистики позволила получить первые транспластомные растения. В отличие от ядерной ДНК, встраивание в которую трансгенов происходит случайным образом, в случае трансформации пластидной ДНК возможна вставка в определенные сайты с помощью механизма гомологичной рекомбинации. Для этого при конструировании векторов для трансформации хлоропластов встраиваемые гены фланкируют последовательностями ДНК (1-2 кб), гомологичными выбранному сайту генома пластид, в который предполагается трансгенная вставка. В качестве такого сайта используют ту часть генома хлоропластов, которая не является функционально важной и инсерция в которую не приведет к негативным последствиям для жизнеспособности растения. В первых работах по трансформации хлоропластов в качестве места встраивания трансгенов использовали транскрипционно неактивные области их генома (спэйсеры). В последнее время для этих целей выбирают транскрипционно активные сайты, содержащие инвертированные повторы, встраивание в которые приводит к последующему корректированию числа копий вставки – ее дупликации на противоположном гомологичном сайте с инвертированными повторами. В результате достигается более высокий уровень экспрессии трансгенов. Например, среди часто используемых сайтов инсерции трансгенов у табака область между генами тРНК изолейцина (TrnI) и тРНК аланина (TrnA), а также между геном тРНК валина (TrnV) и опероном rps 12/7 [Meyers et al. 2010].

Полицистронная экспрессия генов, характерная для хлоропластного генома, делает возможным использование трансгенных конструкций только с одним промотором и одним терминатором для экспрессии всех встроенных генов (как единый оперон). Однако при этом каждая открытая рамка считывания требует отдельный сайт прикрепления к рибосоме (RBS – ribosome binding site) для инициации трансляции. Показана высокая эффективность ряда бактериальных и пластидных RBS, имеющих последовательности, подобные последовательности Шайна-Дельгарно, для обеспечения трансляции встроенных генов у транспластомных растений.

Количество копий молекул пластидных ДНК может достигать десяти тысяч (одна клетка может содержать до 100 хлоропластов, в каждом из которых имеется до 100 молекул ДНК). Естественно, добиться одновременного встраивания чужеродных генов во все эти молекулы невозможно. Поэтому одной из основных проблем получения транспластомных форм является достижение гомоплазии трансформированных клеток, то есть полного исключения у них нетрансформированных пластидных ДНК. В первичных транспластомных клетках последние преобладают: у них имеются лишь единичные молекулы со вставкой привнесенных генов. Для достижения гомоплазии применяется селективная процедура: культивирование «обработанных» рекомбинантными плазмидами тканей на питательной среде с антибиотиком. Делиться на такой среде способны только клетки, в которых имеются трансформированные пластиды. Из каллюсных клеток, полученных на среде с антибиотиком, далее регенерируют растения. Для полного избавления от нетрансформированных пластомов проводят повторные циклы получения каллюса-регенерации растений на среде с высоким содержанием антибиотика.

Трансформация пластид рассматривается как одно из перспективных направлений генетической инженерии растений, поскольку имеет по сравнению с трансформацией ядерной ДНК ряд преимуществ. В силу прокариотической природы ДНК пластид возможно использование механизма гомологичной рекомбинации для сайт-специфического встраивания чужеродной ДНК в их геном подобно тому, как это делают при трансформации прокариот. Благодаря многокопийности ДНК пластид удается добиться очень высокого уровня экспрессии белка-продукта привнесенного гена у транспластомных растений (5-25 и даже более 40% транспластомного протеина ко всему клеточному белку; у трансгенных растений лишь 1-2%). Это делает рассматриваемую модель весьма привлекательной для создания растений-суперпродуцентов ценных веществ. Транспластомные растения по сравнению с трансгенными являются менее потенциально опасными для окружающей среды, поскольку не способны передавать привнесенные гены путем рассеивания пыльцы (наследование пластомных генов происходит в основном по материнской линии).