Ведение лабораторных записей

Тетрадь для оформления лабораторных работ является документом, позволяющим контролировать правильность полученных данных. В ней должны быть записаны сведения, имеющие отношение к выполнению данной рабо­ты. Запись необходимо вести аккуратно, четко и в определенном по­рядке, например:

1. Название опыта, дата его постановки и окончания.

2. Объект исследования.

3. Условия проведения опыта.

4. Основной принцип используемого метода анализа.

5. Полученные результаты.

Цифровой материал приводят в таблицах. Если необходимо, делают графики, диаграммы, рисунки. Каждая лабораторная работа дол­жна заканчиваться собственными наблюдениями, рисунками и выводами, запи­санными в журнале.

ГЛАВА 3

СТЕРИЛИЗАЦИЯ

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под сте­рилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни, как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объек­тов, микробиологи стерилизуют питательные среды, посуду, различные инструменты и другие необходимые предметы с целью не допустить развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах. Термин «стерильность» имеет абсолютное значение.

Различают термическую и холодную стерилизацию. В микробио­логии находят применение следующие способы термической стерилиза­ции: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипяче­ние, из методов холодной стерилизации микробиологи используют сте­рилизацию фильтрованием, ультрафиолетовыми лучами и газообразны­ми средствами. Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяются в первую очередь физико – химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД:

· Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование)

Это наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стери­лизации питательных сред. Он основан на нагревании материала насы­щенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Известно, что температура пара возрастает при повышении его давления (табл. 1).

Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особую эффективность данного способа. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5-минутную экспози­цию в насыщенном паре при 121°. Лишь споры некоторых почвенных микробов погибают при 1 атм только через 20 мин. Стерилизацию па­ром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся толстостенных аппаратах – автоклавах.

Устройство автоклавов. Автоклавы разнообразны по форме, размерам, рабочему давлению, конструкции и другим показателям; они могут быть с ручным управлением, полуавтоматические, автоматические (рис. 31 и 32). Но поскольку все автоклавы предназначены для выполнения одной и той же задачи – стерилизации, основной принцип их устройства один и тот же. Разберём его на примере вертикального автоклава с ручным управлением (рис. 33).

Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление. Его внутренняя часть является стерилизационной камерой (1). В нее помещают стерилизуе­мый материал. Стерилизационная камера снабжена краном (2) для выхода воздуха, манометром (3) для определения давления пара и предохранительным клапаном (4) для выхода пара при повышении давления сверх необходимого и для предотвращения разрыва автоклава. Пространство между стенками (5), называемое водопаровой каме­рой, заполняется через воронку (6) водой (лучше дистиллированной, чтобы не образовывалась накипь) до определенного уровня, который отмечен на специальной водомерной трубке автоклава (7). Выше этого уровня воду наливать не следует, так как при бурном кипении вода мо­жет попасть в трубку, ведущую к манометру, и исказить его показания. В верхней части внутренней стенки водопаровой камеры имеются отверстия (8), через которые пар поступает в стерилизационную камеру. Паровой котёл сверху покрыт защитным кожухом (9). Он предохра­няет котёл от механических повреждений, а работающих около авто­клава - от ожогов. Для создания герметичности автоклав плотно за­крывается массивной крышкой (10) с резиновой прокладкой.

Рисунок 31 .Автоклавы цилиндрические: А – вертикальный с ручным управлением газовый; Б – горизонтальный, полуавтоматический, с электрическим обогревом

Таблица 1 - Температура насыщенного пара при различном давлении

Автоклавирование. Отдельные операции процесса стерилизации в автоклавах разных типов могут быть несколько различными. Соответ­ственно немного различается и техника работы с ними. Однако общий принцип проведения стерилизации в разных автоклавах один и тот же.

Перед работой осматривают автоклав и контрольно – измерительную аппаратуру. При наличии любой неисправности (смещение стрелки манометра с нуля, трещина на водомерной трубке и др.) работать с автоклавом нельзя. После осмотра автоклава в водопаровую камеру наливают воду до верхней отметки на водомерной трубке. В некоторых автоклавах предельный уровень заполнения водой контролируется во­ронкой. В стерилизационную камеру на специальную подставку поме­щают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить, между ними, ина­че они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. Загрузив стерилизационную камеру, устанавливают и плот­но завинчивают крышку (дверь) автоклава. Затем открывают кран, соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и вклю­чают нагрев.

Рисунок 32. Автоклав автоматический

Рисунок 33. Схема автоклава: 1 -­стерилизационная камера; 2 -­ кран для выхода воздуха; 3 - ­манометр; 4 – предохранительный клапан; 5 - водопаровая камера;

6 - воронка для заполнения авто­клава водой; 7 – водомерная трубка; 8 - отверстия для пос­тупления пара в стерилизационную камеру; 9 - защитный кожух; 10 - крышка aвтоклава; 11 - ­подставка для размещения стерилизуемых предметов

После начала парообразования удаляют воздух из стерилизацион­ной камеры. Это необходимое условие стерилизации, так как при одном и том же давлении температура чистого пара выше температуры сме­си пара и воздуха. Поэтому если в автоклаве останется воздух, мате­риал может не простерилизоваться. Наиболее простой и очень распространенный способ обезвоздушивания автоклава - вытеснение воздуха паром. Пар и конденсат отводят либо в сосуд с водой, либо в специальное устройство, соединенное с канализацией. В первом случае на кран (2) надевают резиновый шланг, который опускают в воду. Нача­лом продувания считают появление устойчивой непрерывной струи чистого пара. Пока в автоклаве еще имеется воздух, смесь воздуха и пара, про­ходя через воду, издаст сильный треск. Чистый пар выходит с равномерным шипящим звуком. Его пропускают в течение 10 мин. В целом вся операция с момента появления пара с воздухом должна занимать не более 15 - 20 мин. иначе в автоклаве останется мало воды и он может испортиться. Чтобы уменьшить расход пара (воды), кран открывают не полностью. Степень открывания крана устанавливают на прак­тике при эксплуатации автоклава. В наиболее совершенных автоклавах воздух из стерилизационной камеры удаляют с помощью вакуумного насоса.

Kогда воздух вытеснен, закрывают пароотводный кран, и давление пара доводят до показания, соответствующего pежиму стерилизации. Режим автоклавирования часто выражают в единицах избыточного давления, указывая при этом продолжительность его поддержания. Например: стерилизация при 1 атм в течение 20 мин. На манометре автоклава обозначается именно то дополнительное давление, которое соз­дается в автоклаве сверх нормального. Нередко режим автоклавиро­вания характеризуют температурой и временем. Как только стрелка манометра дойдет до указателя oпределённого дополнительного дав­ления и, следовательно, температура пара достигнет соответствующего значения, поддерживают давление на этом уровне необходимое время путем ручного или автоматического регулирования подачи пара. В ав­токлавах с огневым обогревом подачу пара регулируют интенсив­ностью горения, в автоматических автоклавах - электроконтактным манометром.

По окончании времени стерилизации выключают нагрев автоклава. Давление в автоклаве постепенно падает и сравнивается с атмосфер­ным. Лишь после этого открывают кран, выводящий пар. Преждевре­менное открывание крана недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. Когда пар выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом осторожность во избежание ожога па­ром лица и рук. Удаление пара из стерилизационной камеры автокла­вов, оснащенных вакуумным насосом, осуществляют с помощью насосa. Одновременно происходит подсушивание стерильного материала.

Поскольку автоклав является аппаратом, работающим при высо­ких давлениях и температурах, неправильное обращение с ним может быть причиной несчастных случаев. Установка автоклава и работа с ним производятся при строгом и точном выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица.

Подготовка сред к стерилизации. При автоклавнровании 3 – 5%

жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистил­лированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию.

Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они предохраняют cpeдy от заражения микрофлорой, находящейся в окружающем воздухе. Пробки должны быть дocтаточно плотными, чтобы выполнить эту функцию, но с равномерным распре­делением волокон ваты, так как через них происходит газообмен куль­туры с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки должна быть около 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5 – 2,0 см (рис 34). Для сохранения фор­мы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.

Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпач­ками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизо­ваться в автоклаве, целлофаном. Фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд иначе среды не нагреются до нужной температу­ры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завёртывают в двойной слой обёрточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной проб­кой. Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки.

Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практн­ке стерилизация в автоклавах осуществляется при температуре в пре­делах 111-138°С, т. е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111°С не мо­жет считаться надежной; температура выше 138°С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше дав­ление пара, тем сложнее условия эксплуатации aвтоклава. При исполь­зовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными счита­ются следующие режимы стерилизации: 15 - 45 мин при 121°С (1 атм) и 10 - ­30 мин при 126 (1,5 атм).

Микробиологи чаще всего стерилизуют при 0,5 и 1 атм.

Рисунок 34. Ватные пробки: А – приготовлена правильно, Б и В – приготовлены неправильно

Таблица 2 - Зависимость продолжительности стерилизации жидкостей от объёма сосудов

Температура и длительность автоклавирования питательных сред

определяются прежде всего их составом, термоустойчивостыо или тер­молабильностыо компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (сусло пивное, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 15-30 мин. Мясо-пептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилизация начинается фак­тически после того, какагар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации вдвое больше времени, чем тот же объем во­ды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например, тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 в течение 2 ч или 1 ч при 170°С. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см.­

Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причём она, кроме того, и нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 атм либо 1 раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда при 2 атм 2 ч.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать pH среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в её состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, выше температу­ра и больше продолжительность стерилизации, тем интенсивнее происходитгидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатином и даже с aгаpoм. Если среда щелочная, то при сте­рилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и стано­вятся непригодными для использования бактериями сахара. В некото­рых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Особенно часто это наблюдается в присутствии ксилозы. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, со­ли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации раст­воры стерильно объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать одним и тем же способом.

Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объ­ема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения

надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма

емкостей. Это нужно учитывать в практической работе. На­пример, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одно­временно в пробирках и больших бутылях. Если среда стерилизуется по режимам, рекомендованным для малых объемов, содержимое буты­ли может не простерилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчётом на большой объем, среда в пробирке прогревается значитель­но дольше, чем требуется, и может испортиться.

После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2-3 суток в термостате при 30°С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовятзаново.

·Дробная стерилизация (тиндализация)

Дробная стерилизация применяется для обеззараживания сред, разрушающихся под действием температур выше 100°С. Этот прием был введен английским ученым Тиндалем. Принцип тиндализации заключается в том, что прогревают среду или ее компоненты без избыточного давле­ния несколько раз, и в период между прогреваниями дают прорасти жизнеспособным спорам. Предполагается, что развивающиеся из спор клетки погибают при последующем прогревании, не успев образовать новые споры. Прогревание можно осуществлять в парах кипящей воды, т. е. при 100°С или, как говорят, текучим паром. Обработку текучим па­ром проводят 3-4 раза по 20-40 мин в aвтоклаве с незакрытой крышкой, в кипятильнике Коха или на водяной бане с хорошо пригнан­ной крышкой. Время прогревания отмечается с момента энергичного выделения пара.

Кипятильник Коха представляет собой металлический цилиндр, обычно накрытый теплоизолирующим слоем, чаще всего - асбестом. Внутри цилиндра находится сетчатое ведро или подставка на ножках, куда помещают стерилизуемый материал, прикрыв его клеёнкой для защиты от конденсационной воды. На дно цилиндра наливают воду так, чтобы уровень ее не доходил до дна подставки. Кипятильник за­крывают крышкой, в которой имеется отверстие для выхода пара, и нагревают с помощью газовой горелки или электричества. В современных аппаратах Коха имеются терморегуляторы.

В промежутки между прогреваниями среды помещают на сутки в термостат, отрегулированный на 30°С, для проращивания спор. Субст­раты, не выдерживающие нагревания при 100°С, прогревают более осто­рожно: при 70-80°С по 1 ч ежедневно в течение 3 дней или при 60-65°С в течение 5 дней. Между нагреваниями их выдерживают при темпера­туре от 25 до 37°С.

Тиндализация обеспечивает стерильность лишь в том случае, если среда, в которой находятся споры и поддерживаемая между прогрева­ниями температура обеспечивает их прорастание, и с другой стороны, если появившиеся вегетативные клетки вновь не образуют термостой­кие споры. Существенным недостатком дробной стерилизации является и то,что она требует большой затраты времени. Вот почему практиче­ское значение тиндализации в настоящее время весьма ограничено. Этим способом пользуются преимущественно для стерилизации некото­рыхтермолабильных лекарственных веществ и иногда - желатины.

· Стерилизация фильтрованием

Стерилизация фильтрованием широко используется в микробиологической практике. Она применяется для субстратов, не выдерживающих нагревания, например, для жидких сред и растворов, содержа­щих термолабильные белки, витамины, сахара, некоторые антибиоти­ки, а также для сывороток, летучих веществ, например некоторых уг­леводородов и других. Этим способом освобождают культуральную жидкость от клеток микроорганизмов, когда необходимо сохранить содержащиеся в ней продукты обмена в неизменном виде.

Способ заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры, называемые бактериальными. Микробные клетки задерживаются фильтрами главным образом механически, поскольку они крупнее диаметра пор фильтра, а также потому, что поры идут через фильтр чрезвычайно извилисто и на всём протяжении имеют разную форму и неодинаковый размер. Если же фильтр изготовлен из положительно заряженного материала, то имеет место и притягивание бактерий к стенкам пор, поскольку большинство микроорганизмов в водной суспензии имеет на своей поверхности отрицательный заряд. Такой фильтр может эффективно задерживать даже те микроорганизмы, средние размеры которых несколько меньше среднего диаметра пор. Тем не менее поры фильтров должны быть достаточно мелкими не только затем, чтобы обеспечить механическую задержку клеток, но и для того, чтобы микроорганизмы оказались в сфере действия элект­рического заряда стенок.

Диаметр пор определяет область применения фильтров. Стерили­зующими бактериальными фильтрами теоретически можно считать та­кие, размер пор которых не превышает 0,75 мкм. В практике пригод­ность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной филь­трации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например Pseudomonas aeruginosa. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высеивают на питательную среду. Если в течение 5 дней тест – организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Как правило, бактериальные фильтры пропускают L – формы бактерий, вирусы и бактериофаги.

Типы бактериальныx фильтров. Бактериальные фильтры изготавливаются из разных материалов. Они различаются по форме и диаметру пор, обычно указанному на упаковке фильтра или в прилагаемом паспорте. Нередко фильтры выпускаются под определёнными номерами и марками.

Мембранные (коллоидные) фильтры готовят на основе нитроцеллюлозы. Отечественная промышленность выпускает мембранные фильтры диаметром 35 мм. Они представляют собой диски – разного диаметра толщиной 0,1-0,5 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются номерами от 1 до 5.

Во Франции и США фирма «Миллипор» выпускает фильтры с раз­мером пор от 0,01 до 14 мкм.

В последнее время получили распространение мембранные фильтры фабрики «Синпор» ЧССР.

Мембранные фильтры задерживают микроорганизмы почти исключительно благодаря малым размерам своих пор. Адсорбция здесь иг­рает незначительную роль. Через эти фильтры пропускают небольшие объемы жидкости, так как при фильтровании больших объемов проис­ходит закупорка пор и оно затрудняется. Кроме того, при длительном фильтровании возможно прорастание микроорганизмов внутри пор и попадание их в фильтрат. Мембранные фильтры, имеющие диаметр пор 0,1 мм или меньше, называют ультрафильтратами. Их используют для фильтрации вирусов и высокомолекулярных белков.

Асбестовые фильтры известны под названием фильтров Зейтца. Их изготавливают из смеси асбеста с целлюлозой в виде боль­ших плотных (4-6 мм толщиной) листов, которые затем разрезают на диски или квадраты разной величины. Верхняя поверхность пластин флокулирована. Плотность фильтровтем выше (т. е. меньше пористость), чем больше в них асбеста. На пористость фильтров указывают обозначения, имеющиеся на пластинах: индекс ЕК соответствует диаметру пор 1,5-1,8 мкм; EKS - 1,2-1,5; EKS-l - 1-1,2; ЕКП 0,8-1 мкм. Кроме того, в СССР выпускаются асбестовые фильтры, обозначаемые марками Ф2 и СФ. Стерилизующими являются пластины СФ-3 и СФ-4.

Асбестовые фильтры имеют ряд недостатков. Один из основных связан с их химическим составом: при фильтровании из них могут вы­мываться щелочи, соли щелочных металлов, а иногда и соли железа.

Фильтрат загрязняется нежелательными примесями и приобретает ще­лочную реакцию. Это затруднение можно преодолеть путем предварительного промывания фильтра последовательно разведенной кислотой

и дистиллированной водой или удалением первых порций фильтрата.

Другой существенный недостаток фильтров Зейтца состоит в том, что

асбест, будучи отрицательно заряженным, может адсорбировать значителъные количества различных веществ из фильтруемой жидкости.

И, наконец, асбестовые фильтры нередко загрязняют фильтрат волок­нами. Асбестовые пластины относительно, мягкие, они легко искривля­ются и разрываются. Помятые фильтры, а также пластики с надло­мами и трещинами для работы непригодны.

Фарфоровые фильтры были впервые предложены Пастером и Шамберланом в 1884 году. Впоследствии они получили название «свечи

Шамберлана». Их изготавливают из смеси кварцевого песка и каоли­на, прокалённых на огне. Они имеют форму полого цилиндра, закры­того на одном конце. Верхняя часть цилиндра глазурованна. Особенно часто применяются свечи трех размеров: 10 Х 55, 15 Х 105 и 25 Х 205 мм. Пористость их обозначается буквой L с цифрами от 1 до 13, соответственно увеличению плотности фильтра, т. е. уменьшению диа­метра его пор - от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые свечи обозначаются также маркой «В», крупнопористые - маркой «F». Последние исполь­зуются только для фильтрации воды и отделения мелких микроорга­низмов от крупных. Свечи Шамберлана имеют положительный заряд.

Фильтры из инфузорной земли готовят из диатомита или кизельгура, нередко с добавлением асбеста или других материалов. В России выпускается несколько типов таких фильтров под различны­ми названиями. Чаще всего их называют «свечи Беркефельда». Это замкнутые с одного конца цилиндры 5-26 Х 1,5-5 мм, имеющие в верхней части фарфоровую или металлическую головку «Свечи Беркефельда» имеют обозначения W, N, и V, что соответствует диаметрам пор 3 – 4, 5 – 7, 8 – 12 мкм.

Фильтры из стекла. Стерилизующие стеклянные фильтры представляют собой двуслойные диски, изготавливаемые из фрагмен­тов стекла «Пирекс» путем их сплавления. Нижний слой, имеющий по­ристость в пределах 15-40 мкм, служит подставкой. На ней лежит бактерионепроницаемый верхний слой. Это тонкая мелкопористая пластинка. По пористости такие пластинки разделяются на три типа: P- диаметр пор меньше 1 мкм, М - от 1 до 1,7 мкм, С - больше 1,7 МКМ. Но, по­скольку стеклянные фильт­ры отличаются нестандарт­ностью пор, в паспорте, прилагаемом к каждому фильтру, обычно указывается средний диаметр пор данного фильтра. Диски впаяны в стеклянные воронки-держатели. Форма их может быть разной. Осо­бенно широкое распростра­нение получили фильтры Нутча и воронки Бюхнера ( рис. 35) с диаметром пла­стин от 30 до 120 мм.

Стеклянные фильтры имеют отрицательный за­ряд. Но они не столь ак­тивно адсорбируют вещества при фильтровании, как асбестовые, и не загрязняют фильтрат, поскольку материал фильтра из них не вымывается. Из-за нестандартности пор фильтры из стекла перед употреблением обязательно должны быть проверены на стерилизующий эффект.

В настоящее время из всех типов бактериальных фильтров для стерилизации наиболее широко применяются мембранные и асбесто­вые фильтры.

Рисунок 35. Свеча Беркефельда

Рисунок 36. Стеклянный фильтр (воронка Бюхнера), вмонтированная в колбу Бунзена

Работа с бактериальными фильтрами включает ряд этапов:

1.Подготовка фильтров. Фильтр должен быть закреплен в держателе, который вставляется в приемник фильтрата. Обычно при­емником является колба Бунзена.

Для мембранных фильтров имеются многочисленные держатели. Есть, например, прибор, изготовленный целиком из стекла, в котором в качестве опоры фильтра используется крупнопористый стеклянный диск (рис. 37, А). Чаще применяются металлические и пластмассовые держатели. Все они приспособлены для дисков различного диаметра и рассчитаны на фильтрование разных объемов жидкостей.

Асбестовые фильтры монтируют в металлические основы, которые известны под названием «приборы Зейтца» (рис. 37, Б). Асбестовая пластина крепко зажимается винтами между верхней (цилиндр без дна) и нижней (воронкообразный тубус) частями держателя. Опорой для асбестового диска служит сетка или пористая пластинка из не­ржавеющей стали. Трубка держателя, по которой стекает фильтрат, че­рез резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца.

Узкие свечи монтируют в стеклянные трубки с помощью резиновой пробки, которую вставляют в колбу Бунзена (рис. 38). Жидкость фильтруется из трубки внутрь свечи. Узкие свечи можно вставлять и непосредственно в резиновую пробку, закрывающую колбу Бунзена (рис. 39). В этом случае фильтрование происходит изнутри наружу.

Широкие свечи соединяют с колбой Бунзена резиновой трубкой (рис. 40). Свечу помещают в сосуд, куда наливают фильтруемую жидкость. Фильтрование при этом идет снаружи, а приемником является внутренняя полость свечи.

Рисунок 37. Приборы для стерилизации фильтрованием: А– со стеклянным держателем; Б – с металлическим держателем

8

Рисунок 38. Керамический фильтр, соединенный с колбой Бунзена при помощи наружного стеклянного цилиндра

Стеклянные фильтры, имеющие форму воронки, вставляют в рези­новую пробку колбы Бунзена .

Перед использованием фильтры, их держатели и приемник фильт­рата должны быть простерилизованы. А мембранные фильтры стерилп­зуют, поместив их в дистиллированную воду, кипячением в течение 30 мин или автоклавированием при 1 атм 15 мин. Сосуд с фильтрами должен быть закрыт ватной пробкой. Иногда мембранные фильтры стерилизуют химическими средствами: окисью этилена в смеси с углекислотой в течение 6 ч или парами формальдегида в течение 24 ч. В по­следнем случае фильтры помещают в эксикатор с разряженным воз­духом, на дно которого наливают 2%-ный раствор формальдегида. Стерилизацию окисью этилена проводят в специальных аппаратах. После химической стерилизации фильтры проветривают в стерильных условиях не менее 5 ч.

Металлические и стеклянные держатели мембранных фильтров за­ворачивают в бумагу вместе с резиновой пробкой и автоклавируют при 1 атм 20-30 мин. Способ и режим стерилизации пластмассовых дер­жателей определяется их термостойкостью. Стерилизация мембранных фильтров вместе с держателем не рекомендуется, так как это может привести к повреждению фильтра. Колбу Бунзена стерилизуют горячим воздухом или в автоклаве при 1 атм 20-30 мин. Пред­варительно горлышко колбы Бунзена закрывают ватной пробкой, а в отводную трубку, которая в дальнейшем присоединяется к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. Весь прибор собирают непосредст­венно перед работой. Мембранные фильтры закладывают в держатель в стерильных условиях.

Рис 39. Керамический фильтр, вмонтированный в колбу Бунзена с помощью

резиновой пробки

Рисунок 40. Керамический фильтр, соединенный с колбой Бунзена резиновой трубкой; 1 – фильтруемая жидкость, 2 - фильтр

Фильтры Зейтца стерилизуют в автоклаве при 1-1,5 атм 20 мин или горячим воздухом при 160°С в течение 1 ч в собранном виде, то есть вместе с асбестовыми пластинками. Не рекомендуется перед стерили­зацией туго завинчивать винты держателя. Их подтягивают сразу по­сле стерилизации.

Свечи чаще всего стерилизуют в автоклаве при 0,5-1 атм в тече­ние 15 мин либо вместе с приемником, либо отдельно. В том случае, если свечи не соединены с резиновыми деталями, их можно стерилизо­вать горячим воздухом. Для сохранения стерильности свечи защищают от соприкосновения с воздухом тем или иным способом. Последнее за­висит от того, как будет монтироваться прибор и в каком направлении пойдет фильтрование.

Стеклянные фильтры, вставленные в резиновые пробки, стерилизу­ют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин вместе с колбой-приемни­ком или отдельно. В первом случае на воронку фильтра, закрытую ватной пробкой, надевают бумажный колпачок, во втором - фильтр с пробкой заворачивают в пергамент или алюминиевую фольгу. Стеклянные фильтры, не соединенные с резиновой пробкой, можно стери­лизовать горячим воздухом.

2.Фильтрование. Через бактериальные фильтры жидкости про­ходят медленно, а длительное фильтрование нежелательно, поскольку при этом, как уже отмечалось, возможно прорастание микроорганиз­мов в порах фильтров и загрязнение ими фильтрата. Поэтому обычно фильтрование ускоряют путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящей­ся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Чаще применяют откачивание воздуха. При этом происходит легкое разбу­хание клеток, чем облегчается их задержка на фильтре. Но в то же время в условиях вакуума возможно вспенивание фильтрата, содержа­щего белок, поэтому фильтрация под давлением, исключающая это явление, считается более благоприятной, хотя, вероятно, и менее удобной в техническом отношении. Не исключено, что при сильном положитель­ном давлении бактериальная клетка сжимается и может проходить че­рез фильтр. Слишком большое разрежение и высокое давление уско­ряют закупорку пор.

Рисунок 40. Прибор для фильтрования под вакуумом в собранном виде: А – держатель с фильтром; Б – приемник фильтрата; В – предохранительная склянка; Г – водоструйный насос; 1 – свеча; 2 – стеклянный сосуд; 3 – трубка из толстой резины; 4- резиновая пробка; 5 – ватный тампон; 6 – вакуумный насос

Фильтрование под вакуумом осуществляют следующим образом. Непосредственно перед работой ватную пробку колбы Бунзена, если она стерилизовалась отдельно, быстро заменяют держателем с филь­тром, а отводной конец колбы соединяют с предохранительной склян­кой, находящейся перед водоструйным насосом (рис. 41). Тампон из отводного конца не вынимают, чтобы сохранить стерильность прием­ника. По окончании фильтрования насос выключают постепенно, так как при резком изменении давления вода из крана может быстро за­полнить предохранительную колбу и попасть в фильтрат. Профильтро­ванные жидкости разливают в стерильных условиях в заранее простерилизованную посуду. Так же, как и при термической стерилизации, их выдерживают 2-3 суток при 30°С и, если в них появится рост мик­роорганизмов, готовят вновь.

Важно помнить, что состав жидкостей, прошедших через бактери­альные фильтры, может меняться вследствие вымывания из фильтров или, напротив, адсорбции на них ряда веществ, и фильтрат (среда) станет непригодным для культивирования данных микроорганизмов. Из асбестовых фильтров, как уже отмечалось, могут вымываться щело­чи и различные соли. Адсорбируются же на фильтрах некоторые жир­ные кислоты, белки, полисахариды. Возможность и степень адсорбции веществ на фильтрах определяются химической природой фильтра, размерами его пор, продолжительностью фильтрования. Большую по­глотительную ёмкость (до 30 и более процентов) имеют керамические (свечи) и асбестовые фильтры. Это важно учитывать при работе с малыми объёмами жидкостей.

Эффективность фильтрования определяется не только качествами фильтра, но и свойствами фильтруемой жидкости: её вязкостью, pH, температурой и др. Жидкости с низкой вязкостью фильтруются легче, поэтому при возможности вязкие жидкости разводят. Скорость фильт­рации возрастает с повышением температуры, так как при этом сни­жается вязкость. Поэтому многие жидкости фильтруют подогретыми. Летучие жидкости нельзя фильтровать с помощью вакуума. Щелочная реакция среды (рH 7,2 – 8,0) и наличие капиллярно – активных веществ (бульон) облегчают фильтрацию. Некоторые вещества,

понижающие поверхностное натяжение, например, сыворотка, желчь, мыла, кислоты, способствуют проникновению бактерий через материалы, содержащие кремний. Трудно фильтруются гетерогенные системы, поэтому предва­рительно их осветляют пропусканием через свечи Шамберлана L1 или L2 через крупнопористые мембранные или даже бумажные фильтры.

3.Очистка бактериальных фильтров. Мембранные и ас­бестовые фильтры используются только один раз; после употребления их выбрасывают. Если стерилизации подвергалась жидкость, содержа­щая патогенные микроорганизмы, то фильтры, прежде чем выбросить, стерилизуют или выдерживают в дезинфицирующем растворе. Свечи Шамберлана и Беркефелъда, а также стеклянные фильтры можно ис­пользовать повторно. При употреблении они загрязняются не только бактериями, но и органическими веществами. Для очистки фильтров применяют различные способы.

Фарфоровые свечи (Шамберлана) сначала промывают дистили­рованной водой, пропуская ее через стенки фильтра в направлении, обратном фильтрованию. Затем фильтры заливают на ночь концентри­рованной серной кислотой, содержащей небольшие количества нитрата натрия и хлорнокислого калия. На следующий день их многократно промывают дистиллированной водой, а затем кипятят в воде для уда­ления растворенного воздуха. Свечи Шамберлана можно обрабаты­вать и