Способы культивирования анаэробных микроорганизмов

Выращивание анаэробных микроорганизмов более сложно, чем культивирование аэробов, так как соприкосновение культур анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют различные приемы, нередко комбинируя их друг с другом.

Выращивание в высоком слое среды. Это наиболее простой способ ограничения доступа воздуха к культуре. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высшим слоем. Так как нельзя стерилизо­вать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и стерильно доливают ею сосуд для культивирования сразу же после посева. Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане 30-40 мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

Если развитие микроорганизмов не сопровождается газообразова­нием, поверхность среды можно залить слоем стерильного вазелинового масла, парафина или их смесью (соотношение 1 : 3), слоем стерильного водного агара либо закрыть сосуды для культивирования стерильными пробками: стеклянной притертой или резиновой.

Культивирование в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости. Поэтому в вязких сре­дах, таких как картофельная или среды с кукурузной либо другой му­кой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например, возбудители маслянокислого или ацетонобутилового брожения. Вяз­кость жидких сред легко увеличить, если добавить к ним 0,2-0,3 % агара.

Выращивание в толще плотной среды. Этим приемом пользуются для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении численности анаэробных микроорганизмов. Посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48-50 агаризованную, желательно осветленную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или переливают стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки Бурри или чашки Петри. Поверхность сре­ды в пробирках заливают парафином. Трубки Бурри – это стеклянные трубки, длиной 20-25 см, диаметром 1,0- 1,5см.Трубки стерилизуют, закрыв oба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку уодного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают этот конец также резиновой пробкой (рис. 43).

Рисунок 43. Трубка Бури: 1 – трубка. Подготовленная к стерилизации; 2 – колонии анаэробных микроорганизмов в толще агаризованной среды

При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов за­сеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки и, после то­го как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхности дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином (рис. 44).

Рисунок 44. Культивирование анаэробов в чашке Петри: 1- агаризованная среда, 2 – парафин

Рисунок 45. Микроанаэростат

Рисунок 46. Стеклянный вакуумный эксикатор

Выращивание в анаэростатах. Анаэробные микроорганизмы мож­но выращивать в анаэростатах - вакуумных металлических камерах, снабженных манометром (рис. 45). Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор (рис. 46). Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90-80%) и углекислоты (10-20%)до давления порядка 67*10 Па (500 мм рт. ст.). Избыточное давление исключает возможность диффузии кислорода воздуха. Для заполнения анаэростатов газовой смесью используют газометры (рис. 47). Газо­метр (А)заполняется отдельным газом или газовой смесью через кран 1. Жидкость, первоначально заполняющая газометр, через кран 2 (кран 3 при этом закрыт) вытесняется в сосуд Б. Затем кран 1 закры­вают, осторожно открывают кран 3, и жидкость из сосуда Б поступает в газометр и вытесняет газ в анаэростат (В). Объем газа, заполняю­щего анаэростат, измеряют по объему жидкости, поступившей из сосу­да Бв газометр. Необходимо помнить, что выпускаемые промышленностью газы даже высокой чистоты содержат, как правило, небольшие количества кислорода. Поэтому, чтобы очистить газы от остатков кислорода, их пропускают через химические поглотители, например, через колонки с раскаленной восстановленной металлической медью.

Для удаления кислорода из окружающей среды при культивирова­нии анаэробов иногда используют вещества, поглощающие кислород. Эти вещества можно поместить на дно большой пробирки, имеющей специальную подставку, на которую ставят пробирку с бактериальной культурой . Удобно использовать специальные сосуды, во внешнюю расширенную часть которых вносят поглощающую смесь, а во внутреннюю - питательную среду с микроорганизмами. Культу­ральный сосуд закрывают ватной пробкой, а сосуд с поглотителем - резиновой, что обеспечивает герметичность системы (рис. 48). Применяют также вакуумные или обычные эксикаторы, в которые на дно или в специальные сосуды помещают поглощающие кислород веще­ства.

Рисунок 47. Газометр (А) и анаэростат (В)

В качестве поглотителя в лабораторной практике используют ще­лочной раствор пирогаллола, дитионита натрия (Na S O ), металличе­ское железо и некоторые другие реактивы. При этом необходимо учи­тывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращивается культура. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия. Поскольку

многие анаэробы нуждаются в углекислоте для биосинтеза веществ клетки, пирогаллол растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната натрия. Полноту поглощения кислорода химическими веществами контролируют, используя раствор, содержа­щий окислительно-восстановительный инди­катор. Для приготовления раствора смеши­вают равные объемы 0,024%-ного раствора NaOH, 0,015%-ного водного раствора мети­ленового синего и 6%-ного раствора глюкозы;

в качестве антисептика к раствору добавля­ют тимол. Перед употреблением в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают в кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро ох­лаждают и помещают в анаэростат. В ана­эробных условиях раствор остается бесцвет­ным.

Удобен в обращении анаэростат системы Газ Пак (Gas Pak), кoторый снабжен палладиевым катализатором, поглощающим кислород, и химическими генераторами водорода (таблетка борогидрида нат­рия - NaHB ) и углекислоты (таблетка бикарбоната натрия и лимон­ной кислоты). После загрузки анаэростата таблетки смачивают водой и тотчас герметически закрывают его крышкой. В таком анаэростате анаэробные условия создаются через 16-20 мин.

Культивирование в средах с восстановителями. Рост многих обли­гатных анаэробов возможен только в средах с низким окислительно- восстановительным потенциалом (Eh). Поэтому в среды для культиви­рования анаэробов рекомендуется добавлять восстановители, например, цистеин, тиогликолевую кислоту или ее натриевую соль, сульфид натрия (Na S), ас­корбиновую кислоту или дитиотреитол. Чаще других используют сульфид и тиогликолат натрия. Обычно готовят 1 % -ные растворы этих восстановителей в 5% -ном растворе бикарбоната натрия, стерилизуют автоклавированием и добавляют к средам сульфид Na из расчета 250-500 мг, а тиогликолат нат­рия от 250 мг до 1 г на 1 л среды. Восстановители следует использо­вать в концентрациях, не влияющих на рост микроорганизмов.

Рисунок 48. Сосуды для выращивания анаэробов: 1 – бактериальная культура, 2 – химический поглотитель молекулярного кислорода

Функции восстановителей выполняют и такие компоненты среды, как глюкоза и другие восстанавливающие сахара, а также пептон. С целью снижения окислительно-восстановительного потенциала к сре­дам для культивирования анаэробов можно добавлять убитые клетки дрожжей, кусочки свежевырезанных тканей паренхиматозных органов животных (почки, печень, сердце) или растительных тканей (клубни картофеля, корнеплоды).

Степень поглощения кислорода и соответственно степень восстановленности среды определяется окислительно-восстановительным потенциалом - Eh, который измеряют электрометрически на потенциометре или с помощью индикаторов таких, как резазурин, феносафранин и нейтральный красный, изменяющих окраску при изменении Eh. Осо­бенно удобен резазурин, который добавляют к средам в концентрации 0,0001 % и стерилизуют вместе с минеральными компонентами среды. В окисленной форме он окрашен в слабо-розовый цвет, восстановлен­ная форма его бесцветна. Резазурин регистрирует окислительно-вос­становительный потенциал выше - 420 В. Феносафранин регистрирует более низкие значения потенциала - 252 В.

Успешному выращиванию облигатных анаэробов способствует вне­сение в среду большого количества посевного материала. Это объяс­няется тем, что при развитии анаэробов в культуральной жидкости накапливаются восстановители, которые связывают часть растворенного кислорода новой среды.

Некоторые экстремальные анаэробы, к которым относятся, например, метанобразующие бактерии и микроорганизмы рубца, погибают даже при кратковременном соприкосновении с кислородом воздуха. Работа с такими микроорганизмами представляет большие трудности и требует специального оборудования. Техника работы с экстремаль­ными анаэробами была разработана Хангейтом. Она включает сово­купность нескольких приемов, главными из которых являются следую­щие:

- среды перед употреблением кипятят для освобождения от растворенного кислорода;

- к средам обязательно добавляют восстановители - цистеин,

сульфид Na, тиогликолат Na;

- пересевы, посевы, разлив сред в сосуды для культивирования

осуществляют в токе углекислоты или водородуглекислотной

смеси;

- культуры выращивают в герметически закрытых сосудах в ат­мосфере газовой смеси, часто с избыточным давлением;

- газы Н , СО или их смеси используют только после очистки от следов кислорода.

В последнее время для культивирования экстремальных анаэробов предложены специальные камеры, которые содержат внутри все необ­ходимое для выполнения бактериологических работ, включая термостат. Камера заполняется газовой смесью, состоящей из 10% Н , 10% СО и 80% N , освобожденной от примеси кислорода. Работу в камере исследователь проводит, надевая перчатки, вмонтированные в камеру. Это оборудование достаточно сложно и дорого, но оно имеет одно неоспоримое преимущество- контакт клеток микроорганизмов с воздухом исключается на всех этапах работы.

Температура

Интервалы температур, в которых возможен рост различных мик­роорганизмов, заметно варьируют. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37°С. У термофилов он значительно выше - от 45 до 60-70°С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5-10°С. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влия­ют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращиваются в термостатах (рис. 49) или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегу­ляторов поддерживается соответству­ющая оптимальная температура. Ме­зофильные бактерии, естественным местом обитания которых является вода и почва, выращивают в интер­вале от 20 до 30°С, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или ки­шечника человека и животных куль­тивируют при более высокой темпе­ратуре – 35 – 37°С.

Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Свет

Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые сол­нечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Поэтому такие микро­организмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естест­венное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фототрофы выращивают в люминостатах, то есть в камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необхо­димая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству.

Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и длинами волн, при которых осуществляют фотосинтез культивируемыe микроорганизмы. Для выращивания пурпурных и зелёных бакте­рий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования микроводорослей и цианобактерий можно

Рисунок 49. Термостат для культивирования микроорганизмов

применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спектрального состава света обращают внимание на интенсивность освещения, которую измеряют с помощью люксметра Ю-16.

Вода

Рост и размножение микроорганизмов невозможны без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в до­ступной для клетки форме, т. е. в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворенных веществ и не может быть использована микроор­ганизмами. Доступность воды в субстрате для развития микроорганизмов выражают величиной активности воды (а ). а = Р/Р , где Р – давление пара раствора (мм рт. ст.), Р - давление пара чистой воды (мм рт. ст.) при данной температуре. Значение а для дистиллирован­ной воды равно 1,00. При растворении различных веществ в воде эта величина уменьшается и соответственно падает доступность для клетки воды.

Микроорганизмы могут расти на средах со значеннем а от 0,99 до 0,63. Потребности в доступной воде у бактерий, как правило, выше, чем у дрожжей и микроскопических грибов. Так, большинство бакте­рий, за исключением галофилов, хорошо растет на средах с вeличиной а от 0,99 до 0,95, минимальная величина а , обеспечивающая рост дрожжей, лежит в пределах от 0,91 до 0,88.

Активность воды в среде можно определить по формуле а =А/100, где А - относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равновесии в закрытом сосуде, содержащем среду. Paз­личную активность воды в питательной среде или субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль, или уравновешиванием небольшого объема среды с большим объемом раствора H SO или солей NaCl, KCl, КNО ), имеющих определенную активность воды.

ГЛАВА 5

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Физиологию, биохимические свойства, циклы развития микроорганиз­мов исследуют, как правило, при работе с чистыми культурами. Чистой, или аксенической, культурой называют такую культуру, которая содер­жит микроорганизмы одного вида. Умение выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популяции, существующей в природе, и под­держивать чистоту культуры - необходимое условие работы с микроор­ганизмами. Выделение чистой культуры обычно включает три этапа: получение накопительной культуры; выделение чистой культуры; определение чистоты выделенной культуры.