Иммуноэлектрофорез.

Рис. 8. Принцип иммуноэлектрофореза.

Стадия 1: электрофорез антигена в агаровом геле. Антиген мигрирует на некоторое гипотетическое расстояние.

Стадия 2: ток выключен. В агаре вырезана канавка и заполнена антителами. Образуется дуга преципитации. Теоретически антиген диффундирует из точечного источника радиально, а антитела из канавки - ровным фронтом. Преципитаты, образующиеся в точках оптимальных соотношении антигена и антител, формируют дугу. Дуга расположена ближе всего к канавке там, где наиболее высока концентрация антигена.

Иммуноэлектрофорез помогает идентифицировать антигены по электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в образце присутствуют и другие антигены.

С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов и идентифицируют миеломные белки (рис.9).

Рис. 9. Основные классы иммуноглобулинов человека в сыворотке крови, выявляемые методом иммуноэлектрофореза. В канавку добавлена антисыворотка кролика. Показано расположение основных глобулиновых фракций. Выявлены три из пяти основных классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgА и IgМ. Дуга преципитации IgG, распространяется от γ-области до ά₂-глобулиновой области, что отражает чрезвычайную гетерогенность популяции антител как по аминокислотному составу, так и по суммарному заряду.

На основе сочетания электрофореза с иммунопреципитацией разработано несколько удачных методов, в каждом из которых перемещение антигена в электрическом поле приводит к его контакту с антителами. Встречный иммуноэлектрофорез может применяться для определения антигенов, миг­рирующих в агаре к положительно заряженному электроду.

Рис.10. Встречный иммуноэлектрофорез. Из-за эндосмоса антитела движутся в геле «назад»; антиген, отрицательно заряженный при данном рН, перемещается к положительному электроду и при контакте с антителами образует преципитат.

Данный метод занимает меньше времени и более чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для идентификации антигенов вируса гепатита В и соответствующих антител, антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к Asperqillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе.

Ракетный электрофорез - это количественный метод, предусматриваю-щий внесение антигена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты, длина которой определяется концентрацией антигена.

Рис.11. Ракетный электрофорез. Антиген, в данном случае сывороточный альбумин человека, подвергается электрофорезу в геле, содержащем антитела. Расстояние между стартовой лункой и передним краем дуги, имеющей форму ракеты, зависит от концентрации антигена. В данном случае относительные концентрации сывороточного альбумина человека составляют (слева направо) 3, 2 и 1.

Как и встречный электрофорез, это- быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно заряженному электроду. Таким образом, ракетный электрофорез подходит для белков, например альбумина, трансферрина и церулоплазмина, в то время как концентрацию иммуногло-булинов обычно определяют методом простой радиальной иммунодиффузии.

Один из наиболее удачных вариантов ракетного электрофореза - двумерный или перекрестный иммуноэлектрофорез Лорелла. При этом на первом этапе смесь антигенов электрофоретически разделяют в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием электрического поля в другом направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно определить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример-это оценка степени конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто происходит при обострении в сыворотке больных системной красной волчанкой или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревматоидного артрита, а также в других случаях.

Рис.12. Перекрестный иммуноэлектрофорз.

а. Антигены разделяются по электрофоретической подвижности в агаровом геле. Узкую продольную полоску (ограничена прерывистой линией), содержащую разделенные антигены, вырезают из геля и прикладывают к другому гелю, содержащему антисыворотку. Затем проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном первому; при этом антигены реагируют с антисывороткой, содержащейся в геле, с образованием пиков преципитации. Площадь под пиком зависит от концентрации данного антигена.

Рис.12.

б. Электрофореграмма, показывающая превращение компонента комплемента СЗ (С3 → С3с) в сыворотке. Гель дополнительно окрашен. В данном случае дуги сливаются между собой, поскольку антигены имеют общие детерминанты.

Рис.12.

в. «Горная фантазия», - эта электрофореграмма, демонстрирует удивительные возможности перекрёстного иммуноэлектрофореза для разделения сложной смеси антигенов.

Иммунофлюоресценция заключается в том, что к молекуле антител присоединяется какой-либо флюоресцирующий краситель, например изотиоцианат натрия. Антигенный материал (бактерии, клетки или их компоненты), присоединившие меченые антитела, становятся видимыми в ультрафиолетовом свете. Метод не количественный, но весьма важный в иммуноморфологии для определения локализации антигенных структур или антител.

Конкуренция с радиоактивным антигеном (радиоиммунологический метод) — один из самых современных методов. Учет реакции антиген — анитело может осуществляться с помощью радиоизотопных методов в случае использования «меченых» антител или антигенов. Измерение радиоактивности преципитата дает возможность оценить количество антител или антигена в исследуемых образцах. Это увеличивает объективность оценки, убыстряет учет и повышает чувствительность реакции. Наиболее чувствии-тельны (определение 1 — 10 нг вещества) методы конкуренции за антитела немеченого антигена с меченым. Принцип метода заключается в следующем. Используют стандартное количество антисыворотки против исследуемого антигена и стандартное количество этого антигена, меченного радиоактив-ными ¹²⁵I, ¹³¹ I, ²Н или другим изотопом. Соотношение их таково, что 70—80% меченого антигена связываются антителами, образовывая радиоактивный преципитат с величиной радиоактивности N. Если в реагирующую систему внести исследуемый на присутствие данного антигена субстрат, то при наличии антигена он конкурирует с меченым антигеном и радиоактив-ность преципитата снижается. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем меньше радиоактивность преципитата. С помощью этого метода определяют концентрацию в крови, моче и других субстанциях таких веществ, которые из-за ничтожных концентраций не выявляются биохимическими методами (гормоны: инсулин, гормон роста, АКТГ, го-надотропин, дигоксин, соматотропин и др.).

Рис. 13. Метод выделения мембранного иммуноглобулина (IgМ - 8S) с поверхности В-лимфоцитов.

1. Мечение поверхностных белков лимфоцитов ¹²⁵I в присутствии лактопероксидазы (ЛП).

2. Лизис клеток и выход поверхностных белков в раствор.

3. Осаждение меченых иммуноглобулинов с помощью специфической анти-Ig-сыворотки.

4. Отмывание и осаждение преципитата.

5. Разрушение преципитата и электрофоретический анализ легких и тяжелых цепей в полиакриламидном геле

Иммуноферментный метод представляет собой разработку самых последних лет. По чувствительности он не уступает предыдущему, но более прост при наличии коммерческих реагентов. На стенки полистереновых пробирок сорбированы антитела против определенного антигена. В эту пробирку вносят исследуемый субстрат. При наличии данного антигена он соединяется с антителами. Субстрат сливают и в пробирку вносят антитела против этого же антигена. Эти антитела мечены ферментом, чаще всего пероксидазой хрома. Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и также остаются на стенках пробирки. Содержимое пробирки заменяют на смесь хромогена (ортофенилендиамин) с субстратом для данного энзима — Н₂0₂. Если в исследуемой жидкости был искомый антиген, энзим фиксируется на стенках пробирки, разложит Н₂0₂: выделившийся кислород окрасит хромоген в желтый цвет.

Метод Уанье предполагает использование для учета преципитации фотоэлектронефелометра, с помощью которого регистрируется изменение оптической плотности сыворотки после добавления антигена. При разбавлении сыворотки дистиллированной водой оптическая плотность снижается. Если в сыворотке имеются антитела, а в качестве разбавителя используют водный раствор антигена, то кривая изменения оптической плотности будет иная. Вначале происходит снижение оптической плотности, при накоплении достаточного количества антигена снижение прекращается, затем наблюдает-ся повышение оптической плотности смеси антиген — антитело.

Феномен лизиса — способность некоторых антител растворять клетки, против которых они возникли. Эти антитела применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам — эритролизинами, или гемолизинами. Реакции иммунного лизиса характеризуются тем, что они не происходят при наличии только двух ингредиентов — антигена и антитела. Необходимо присутствие третьего компонента, получившего название комп­лемента. В разных количествах комплемент содержится в сыворотке крови многих животных; особенно много его в сыворотке крови морских свинок. Вначале реакция идет по типу агтлютинации, затем к комплексу антиген-антитело присоединяется комплемент и происходит локальное растворение оболочки бактерий, эритроцитов или других клеток.

Феномен цитотоксичности определяется антителами, называемыми цитотоксинами. Их действие заключается в том, что они проявляют токсический эффект, лишая клетки жизнеспособности. Реакцию по выявлению цитотоксинов ставят со взвесью клеток в изотоническом буферном растворе хлорида натрия. К ним добавляют краситель, например, эозин или трипановый синий. Живые клетки не красятся, погибшие клетки быстро воспринимают краску (в течение 30 с). Если к взвеси клеток доба-вить иммунную сыворотку, содержащую цитотоксины и комплемент, то клетки будут гибнуть и при пробе с красителями окрасятся. Процент погибших клеток свидетельствует о количестве цитотоксинов в сыворотке крови. Реакция требует обязательного присутствия комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на описанном выше свойстве комплемента присоединяться к комплексу антиген — антитело. Говоря более точно, комплемент фиксируется на специальном участке тяжелой цепи молекулы антитела. Однако этот участок становится доступным только после присоединения антитела к антигену. Соединившись с одним комплексом антиген — антитело, комплемент не может перейти на другой комплекс, вводимый в реагирующую систему после взаимодействия первого комплекса и добавленного в известном количестве комплемента. В качестве второго комплекса обычно используют так называемую гемоли-тическую систему — смесь эритроцитов барана с антителами против них. Если первый комплекс является комплексом антиген — антитело, то свободного комплемента в реагарующей смеси не будет; гемолиза эритро­цитов не произойдет. Наоборот, если в исследуемом материале (например, в сыворотке крови) нет антител к использованным антигенам, то комплемент останется свободным и обеспечит гемолиз эритроцитов. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), изучений противотканевых антител и аутоантител; она широко используется при диагностике ряда вирусных инфекций.

Феномен специфической задержки часто используют для сравнения двух изучаемых антигенов. Например, готовят иммунную сыворотку против эритроцитов мыши. Чтобы определить, содержатся ли в ней антитела против эритроцитов родственного вида животных (крысы), сыворотку обрабатывают эритроцитами крысы. Если уровень антител в сыворотке снижается, то имеются родственные антигены, если совсем падает, то антигены идентичны. С помощью этой реакции проанализированы на тождественность или нетождественность многие родственные антигены и гаптены.

Реакция нейтрализации токсинов. Антитоксинами называют антитела против бактерийных и некоторых других (например, змеиный яд) токсинов антигенной природы. Антитоксины, соединяясь с соответствующими токсическими веществами, нейтрализуют их. Степень нейтрализации может быть учтена посредством введения восприимчивому животному смеси токсин- антитоксин. Количество антитоксина в иммунной сыворотке ха­рактеризуют тем количеством минимальных смертельных доз токсина, которое может быть нейтрализовано определенным количеством сыворотки. Реакцией нейтрализации пользуются для определения концентрации токсинов возбудителей дифтерии, столбняка и др. Для этого применяют стандартизированные антитоксические сыворотки.

Феномен опсонизации заключается в том, что антитела усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов в отношении тех антигенных субстанций или микроорганизмов, против которых они получены. Например, активность фагоцитов в отношении стафилококков значительно усиливается, если обработать лейкоциты или донора лейкоцитов антистафилококковой сывороткой. Такое действие связывали с наличием особых антител опсонинов. Следует, однако, иметь в виду, что специальных антител опсонинов, гемолизинов, бактериолизинов или преципитинов нет. Это лишь проявления основной функции молекул иммуноглобулинов дать специфический комплекс антиген — антитело.

Д. Грей приводит хороший пример единства и многообразия этой функции. Антитела, приготовленные против пневмококкового полисахарида I типа, могут:

1) вызывать агглютинацию пневмококков I типа и набухание их капсулы;

2) вызывать преципитацию растворимого экстракта из пневмококков I типа;

3) присоединять комплемент, т. е. обеспечивать РСК;

4) оказывать опсонизирующее действие на лейкоциты в отношении пневмококков I типа;

5) осуществлять специфическую защиту животных против пневмококковой инфекции.

Несмотря на это, в различных конкретных экспериментальных или клинических ситуациях предпочтение отдают конкретным реакциям антиген — антитело. При диагностике брюшного тифа используют реакцию Видаля — агглютинацию бактерий, для анализа антигенных компонентов сложных биологических жидкостей или тканевых экстрактов — реакции преципитации в агаре в виде иммунодиффузии или иммуноэлектрофореза. При работе с токсинами и многими растворимыми антигенами пользуются методами пассивной гемагглютинации. Для определения уровня гормонов в крови наиболее приемлем радиоиммунологический метод и т. д. Различные классы иммуноглобулинов различно проявляют функцию соединения с антигеном.