ХАРАКТЕРИСТИКА иммунологических методов анализа и диагностики.

Реакции специфического взаимодействия сывороточных антител с антигенами, против которых они направлены, проявляются в виде нескольких основных феноменов. Эти феномены легко наблюдать в лабораторных условиях.

Феномен агглютинации заключается в том, что бактерии, животные клетки или другие корпускулярные антигенные частицы, находящиеся во взвеси, под влиянием антител склеиваются между собой. Иначе говоря, если к взвеси бактерий в изотоническом растворе хлорида натрия (реакция идет только в присутствии электролитов) добавить сыворотку иммунизированного этими бактериями животного, то микроскопические элементы взвеси склеиваются между собой и оседают на дне пробирки в виде крупных, различимых невооруженным глазом хлопьев или зерен. Аналогичное явление происходит и при использовании, например, эритроцитов барана и сыворотки животных, которым вводили эти эритроциты.

В лабораториях весьма часто используют не прямую, а пассивную агглютинацию. Этот вариант реакции применяют при работе с растворимыми антигенами и др. Для получения феномена агглютинации антиген предварительно присоединяют к корпускулярному носителю — танированным эритроцитам, частицам латекса, окиси бария и др. Добавление антител к взвеси таких частиц — пассивных носителей антигена, приводит к их склеиванию. Реакция пассивной агглютинации характеризуется высокой чувствитель-ностью и пригодна для выявления весьма малых количеств антител.

Следует отметить, что в реакциях агглютинации и многих других по выявлению антител количество антител в иммунной сыворотке или в других жидкостях оценивается их титром.

Под титром антител понимают то наибольшее разведение сыворотки или иной жидкости, при котором реакция антиген — антитело все еще учиты­вается. Например, титр антител может быть равен 1 :28 или 1 :2048. Каждое последующее разведение сыворотки ,. обычно вдвое больше предыдущего (1 : 2, 1: 4, 1 : 8 и др.).

Феномен преципитации — эффект укрупнения растворимых антигенных субстанций под влиянием антител с возникновением помутнения прозрачных растворов. В этом случае мы сталкиваемся с явлением агрегации растворенных частиц. В зависимости от технических условий постановки и учета данной реакции антиген — антитело они получили разные названия.

Классическая реакция преципитации.

Если раствор антигена в определенном соотношении смешивают с антисывороткой, то образуется преципитат. Количественный анализ этого процесса (например, методом, который схематически изображен на рис.1) дает информацию как о содержании, антнтел в иммунной сыворотке, так и о валентности антигена, т. е. числе участков связывания с антителами (эпитопов). Эта величина может существенно варьировать в зависимости от структуры антигена, его размеров, а также вида животного, от которого были получены антитела.

В случае гипериммунной кроличьей антисыворотки, содержащей преимущественно иммуноглобулины класса G(IgG), овальбумин проявляет валентность, примерно равную 10, а у тиреоглобулина человека обнаруживается до 40 поверхностных детерминант.

Как следует из кривой преципитации (рис.1), по мере добавления антигена вначале достигается оптимум, а затем количество образующегося преципитата постепенно уменьшается.

Рис.1. Количественная реакция преципитации между овальбумином кролика и специфическими антителами. Антитела в основном представляют собой IgG.

К постоянному объему антисыворотки в нескольких пробирках добавляют различное количество овальбумина. После инкубации преципитат осаждают центрифугированием и взвешивают. Супернатант разделяют на две части: к одной добавляют антиген, а к другой - антитела, и тем самым определяют наличие в супернатанте соответственно антител и антигена.

Количество антител в сыворотке можно вычислить по точке эквивалентности, в которой супернатант не содержит ни антител, ни антигена.

В этой точке весь добавленный антиген образует преципитат со всем доступным количеством антител. Количество антител в 0,1 мл сыворотки тем самым соответствует разности веса преципитата и веса добавленного антигена.

Анализ преципитата, образованного при избытке антител, когда практически все детерминанты антигена связаны с антителами, позволяет определить молярное соотношение антител и антигена и таким образом оценить эффективную валентность антигена.

При этом в супернатанте появляются растворимые комплексы антигена (Аг) и антител (Ат), многие из которых имеют строение Аг₄Ат₃, Аг₃Ат₂ и Аг₂Ат (рис.2 ). При большом избытке антигена (рис.1 ), как показывает метод ультрацентрифугирования, комплексы преимущественно имеют строение Аг₂Ат, что хорошо согласуется с наличием двух антигенсвязывающих центров, т.е. двухвалентностью молекул IgG. Во всех промежуточных случаях, в реакции антиген-антитело образуются трехмерные сетевидные структуры, которые соединяются между собой преимущественно за счет взаимодействия Fс-фрагментов и формируют крупные осаждающиеся агрегаты.

Рис.2. Комплексы, образуемые между гипотетическим четырехвалентным антигеном и двухвалентными антителами, смешанными в разных соотношениях.

Практически трудно допустить, что участки связывания антигена лежат в одной плоскости и образованы идентичными детерминантами (как это показано на рисунке).

а. При огромном избытке антител все участки связывания антигена заняты и по молярному соотношению Ат:Аг в комплексах можно оценить валентность антигена,

б. В точке эквивалентности образуются крупные комплексы, которые затем агрегируют и образуют типичный преципитат. Агрегация и преципитация ингибируются при высокой концентрации соли.

в. При большом избытке антигена заняты два антигенсвязывающих центра каждой молекулы антитела, и доминирует комплекс Аг₂Ат.

г. Моновалентный гаптен соединяется с молекулами антител, но не способен к их перекрестному связыванию.

Прежде чем говорить о вариантах реакции, следует заметить, что нерастворимый комплекс антиген — антитело выпадает только в определенном диапазоне эквивалентных концентраций реагирующих молекул. В случае большого избытка антител или антигена феномен преципитации не развивается. Это не значит, что взаимодействия реагентов не произошло. Оно произошло, но образовался растворимый комплекс антиген-антитело. Реакция кольцепреципитации ставится таким образом, что в пробирке на столбик иммунной сыворотки, содержащей антитела, наслаиваются различные разведения прозрачного раствора антигена. На границе соприкосновения двух взаимодействующих растворов антигена и антител через несколько минут или часов возникает опалесцирующее кольцо преципи-тации.

Количественные измерения методом нефелометрии.

Небольшие агрегаты, образующиеся при смешивании разбавленных растворов антигена и антител, увеличивают мутность раствора, которая мо­жет быть измерена по рассеянию падающего света (нефелометрия). Увеличение чувствительности достигается при использовании монохрома-тического света лазера и при добавлении в раствор полиэтиленгликоля, увеличивающего размер агрегатов.

В хорошо оснащенных лабораториях, которым доступно соответствующее оборудование, данный метод постепенно вытесняет простую радиальную иммунодиффузию при количественной оценке иммуноглобулинов, компонента комплемента С3, С-реактивного белка и т.д.

Весьма удобен вариант реакции преципитации в стеклянных капиллярах. Капилляр опускают в сосуд с иммунной сывороткой и заполняют треть пространства внутри капилляра. Затем капилляр переносят в раствор антигена и заполняют еще треть капилляра. После этого капилляр перевора-чивают несколько раз и оставляют на 18—24 ч. Зерна преципитата собираются столбиком на нижнем мениске капилляра.

В последние годы широко используют реакцию преципитации в агаре мето-дом двойной или встречной диффузии.

Визуализация реакции преципитации в гелях. Двойная диффузия по Ухтерлони.

В лунки, вырезанные в агарозном геле, помещают антиген и антитела. Они диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат (мутно-белая линия) в том участке геля, где их соотношение оптимально. Если препарат содержит несколько антигенов, то образуется несколько линий. Иммунологическое родство между двумя антигенами можно оценить, проводя реакции преципитации в соседних лунках. Образованные каждым из антигенов линии могут либо полностью сливаться- это указывает на их иммунологическую идентичность, либо сливаться частично и образовывать так называемую «шпору»-это свидетельствует о частичном родстве антигенов, либо в случае неродственных антигенов пересекаться.

Рис..3. Двойная иммунодиффузия по Ухтерлони. Когда кроличья антисыворотка (центральная лунка) реагирует в агаровом геле с четырьмя различными антигенами (периферические лунки), образуются линии преципитации. В случае неродственных антигенов эти линии пер­секаются, при частичном родстве формируются «шпоры».

Причины формирования различных линий преципитации объяснены на рис. 4. Следует подчеркнуть, что даже полностью сливающиеся линии свидетельствуют лишь об иммунологической идентичности, причем только для данной антисыворотки, а вовсе не об идентичности самих молекул антигенов. Так, например, очищенные антитела к динитрофенилу (ДНФ) дадут сливающиеся линии при реакции с ДНФ- овальбумином и ДНФ- сывороточным альбумином, если эти антигены поместить в соседние лунки.

Рис. 4. а. Линии преципитации сливаются, когда два антигена с помощью данной антисыворотки неразличимы,

б. Образование «шпоры» при частичном родстве антигенов. Если антигены имеют общую детерминанту х и различные детерминанты у и z, а антисыворотка специфична по отношению к х и у, то антиген с детерминантами х и z может реагировать только с антителами, направленными к х. Антитела к у (Ат_у) пересекают линию преципитации и реагируют с антигеном из соседней лунки, имеющим детерминанту у; в результате об­разуется «шпора»,

в. Пересечение линий преципитации в случае неродственных антигенов.

Там, где реагенты присутствуют в сбалансированном соотношении, выпуклость образующейся линии преципитации будет направлена в сторону того из них -антигена или антитела, у которого меньше мол. масса. Это есть следствие меньшей скорости диффузии, которую обычно имеют молекулы с большим размером.

Чувствительность метода преципитации в геле можно повысить, если ввести антисыворотку в агар; при этом в гель диффундирует только антиген (агар может содержать до 90% сыворотки;). Данный метод, называемый простой радиальной иммунодиффузией, используется для количественного определения антигена.

Чашки заливают агаром, в котором делают две или больше лунок. В одну вносят антиген, в другую — иммунную к нему сыворотку. Происходит диффузия реагентов в агар, и, на месте встречи антигена и антител в зоне их эквивалентности образуются полосы преципитации. Эта реакция носит аналитический характер и позволяет определить количество отдельных антигенных субстанций в смеси антигенов, а также установить идентичность сравниваемых антигенов. Широко распространенным вариантом метода является метод радиальной иммунодиффузии.