Методы диагностики заразных болезней

(Алешкевич В.Н.)

Бактериологическое исследование применяется для выявления патогенных бактерий в материале от больных животных или их трупов, обнаружение микробов в объектах внешней среды, кормах, мясе и т.д.

Исследуемый материал по возможности собирают в асептических условиях в стерильную посуду (от трупов не позднее 2-3 часов после смерти животных, в ряде случаев целесообразен вынужденный убой 1-2-х из группы больных животных) и доставляют в ближайшее время в не консервированном, консервированном(30%-ым водным раствором глицерина или вазелиновым маслом, 0,5%-ым раствором фенола), замороженном (допускается при туберкулезе и др.) виде с сопроводительным документом в лабораторию (в нем указаны дата взятия, характер и источник материала, основные клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения, цель исследования).

Бактериологические исследование включает: бактериоскопию мазков исследуемого материала, выделение чистой культуры бактерий с последующим изучением морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и патогенных свойств бактерий.

Микроскопия позволяет обнаружить в материале микробов, изучить их морфологию (форму, размер, взаимное расположение клеток, структурные компоненты: капсулы, споры, жгутики, включения) и тинкториальные свойства. Для этого из патологического материала готовят мазки-отпечатки из органов, тканей или препараты-мазки из другого исследуемого материала, высушивают на воздухе, фиксируют (чаще фламбированием или химическим способом) и окрашивают тем или иным методом в зависимости от направленности исследования. Окраску микробов проводят простым (один краситель) и сложным методами( основной и дополнительный краситель, вспомогательные реактивы).Сложные методы (Грама, Циль-Нильсена, Романовского-Гимза, Гинса и др.)позволяют отличить одну группу микробов от другой, выявить отдельные элементы микробной клетки( споры, капсулы).

Для обнаружения некоторых бактерий (напр., возбудителя туберкулеза) патологический материал предварительно обрабатывают одним из методов обогащения, повышая в нем концентрацию бактерий и избавляясь от посторонних микробов.

При обнаружении бактерий используют и люминесцентную микроскопию. Для определения подвижности микробов используют микроскопию молодой (12-24 ч.) живой культуры с помощью препаратов «раздавленная или висячая капля», а также на основе роста бактерий в полужидком МПА.

Выделение культуры бактерий проводят путем посева материала на соответствующие (в зависимости от питательных потребностей возбудителя) питательные среды. Посев на плотные питательные среды в бактериологических чашках проводят путем растирания шпателем нескольких капель материала по поверхности среды. При исследовании паренхиматозных органов убитых или павших животных обжигают или фламбируют кусочек органа, затем надрезают его стерильными ножницами и с помощью пинцета проводят надрезанной поверхностью по питательной среде в чашке. В жидкую среду посев материала делают пастеровской пипеткой. С целью получения роста изолированных колоний (при их пересеве получают чистую культуру бактерий) микробов чаще используют дробный посев или пересев (метод Дригальского) на несколько чашек с плотной средой. Чистую культуру получают также высевая патматериал на элективные среды, заражением лабораторных животных и прогреванием содержащего споры материала в водяной бане при 80⁰ С 30 мин.

Засеянные чашки и пробирки инкубируют в термостате при оптимальной для роста каждого вида бактерий температуре (чаще 37⁰ С) в течение обычно 1-2 суток (некоторых случаях до 30-60 суток, например возбудитель туберкулеза).

Для идентификации выделенных бактерий изучают только чистые культуры. Идентификацию проводят всесторонним изучением их культуральных, морфологических, биохимических, серологических и патогенных свойств.

При оценке роста на жидких питательных средах определяют степень и характер помутнения среды, характер осадка, наличие пленки и пристеночного кольца. При изучении роста микробов на твердых средах обращают внимание на характер роста (скудный, пышный, однородный или неоднородный), число колоний, их величину, форму, структуру, цвет, прозрачность.

Биохимическую активность изучают чаще всего на дифференциально-диагностических средах (Гисса, Клиглера, Эндо, Кристенсена и др.), определяя при этом сахаролитические, протеолитические и редуцирующие свойства.

Антигенную структуру микробов изучают при помощи различных серологических реакций – РА, РН, РП, РСК и др., позволяющих выявить различия между близкородственными видами некоторых бактерий, а также отдельными штаммами внутри вида.

Фаготипирование, как метод идентификации микробов, проводят при помощи бактериофагов.

Определение патогенных свойств бактерий проводят путем заражения лабораторных животных культурами или фильтратом культуры (при определении токсинообразования).

После изучения свойств бактерий сопоставляют полученные данные с признаками бактерий, имеющимися в соответствующих инструкциях, ГОСТах по лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, определителе микробов (Д.Берджи, 1994) и проводят их родовую и видовую дифференциацию. В сомнительных случаях проводят повторное исследование материала. Результаты исследования записывают в журнал бактериологических экспертиз, указывая какой микроб выделен из исследуемого материала.

Вирусологическое исследование – комплекс методов исследования, позволяющее распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.

Характер и методика взятия проб при различных вирусных болезнях неодинаковы. При взятии материала для выделения вируса следует исходить из плюрализма вирусов. Его отбирают с учетом патогенеза изучаемой инфекции, как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2-3 часов после смерти или убоя (наблюдается феномен посмертной аутостерилизации и посмертных изменений тканей) и быстро помещают в условия низкой температуры. Материал отправляют в лабораторию в термосе с условиями поддержания низкой температуры, в стеклянных флаконах (пробирках) с притертыми пробками, либо консервированном виде 50%-ным растровом глицерина.

Исследование необходимо начинать сразу после поступления материала. Если по каким-то причинам (отсутствие эмбрионов птиц, тканевых культур) оно откладывается, присланный материал необходимо поместить в низко – температурный морозильник при – 27…40…70⁰С. Сначала проводят исследования, позволяющие непосредственно выявить вирус или его антигены в материале – световую, люминесцентную (метод иммунофлюоресценции), электронную микроскопию и иммуноферментный анализ.

Световая и люминесцентная микроскопия используется для обнаружения крупных вирусов (в. оспы), выявления внутриклеточных включений (напр. Бабеша-Негри при бешенстве), изучения цитопатогенного действия вируса на клетки (ЦПД), определения типа нуклеиновой кислоты вируса (метод флюорох-ромирования). Для световой микроскопии препараты из патологического материала окрашивают специальными методами: по Морозову, Маккиавелло, Рома-новскому-Гимзе – при выявлении вирионов; по Муромцеву, Манну, Туревичу и др. – при выявлении включений. Для люминесцентной микроскопии при окраске препаратов используют флуорохромы (акридин оранжевый и др.). Электронная микроскопия (используют специально приготовленные препараты) позволяет выявлять вирусные частицы в различных материалах, дифференцировать их по форме, размеру и ультраструктуре. Метод иммунофлюоресценции проводят с помощью иммунных сывороток меченных флюорохромами с целью индикации, идентификации вирусов и вирусных агентов.

Иммуноферментный анализ (ИФА) применяется в гистохимическом и твердофазном варианте, где используются антитела меченные ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.). Гистохимический вариант ИФА предназначен для идентификации вируса в патматериале или культуре клеток. Твердофазный вариант ИФА используется как для определения антигенов, так и определения антител и их титров в целях ретроспективной диагностики.

Для выделения вируса используют эмбрионы птиц, культуры клеток, лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Подготовку вируссодержащего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помощью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования. Затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро и при отрицательных результатах используют для заражения. При получении отрицательных результатов проводят не менее трех пассажей на биологических объектах того же вида.

При выделении в испытуемом материале вирусного агента следующим этапом исследования является идентификация вируса (видовая и группоспецифическая) с помощью серологических методов. С этой целью используют РН, РСК, РИД, РТГАд, РЗГА, РНГА, ИФА. Данные методы позволяют выявить также и антитела в сыворотках переболевших животных. При этом необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни (обычно через 14 дней). Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4⁰ С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах.

В настоящее время в лабораториях для идентификации возбудителя используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая определить нуклеотидную последовательность РНК или ДНК инфекционного агента.

Результаты исследования записывают в журнал вирусологических исследований. Диагноз на инфекционную болезнь может быть поставлен при учете эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований.

Микологическое исследование–комплекс методов, применяемых для обнаружения и идентификации грибов в исследуемом материале.

Микологическое исследование при диагностике микозов включает микроскопию патологического материала для обнаружения возбудителя в органах и тканях больного животного, выделение чистой культуры и ее идентификацию. В неясных случаях проверяют патогенность выделенных культур биологической пробой. Дополнительно используют серологический, аллергический, люминесцентный методы диагностики. Гистологическое исследование применяют для диагностики глубоких микозов, возбудитель которых не культивируется на питательных средах (риноспоридиоз).

Отбор патологического материала при дерматомикозах производят с периферии свежих, пораженных очагов (корочки, волосы); при эпизоотическом лимфангите, споротрихозе, актиномикозе, актинобациллезе материал извлекают из не вскрывшихся абсцессов, а также исследуют гранулематозные очаги после предварительной дезинфекции их; при висцеральных микозах исследуют гной, мочу, органы и ткани, соскобы со слизистых оболочек. Патологический материал помещают в стерильные чашки Петри (при дерматофитозах можно в чистые стерильные пакеты). Для лучшего выявления элементов грибов из патологического материала готовят препараты на предметном стекле в капле 10-20%-ного раствора едкого натра с последующим добавлением 50%-ного водного раствора глицерина. Микроскопируют неокрашенные препараты (реже окрашенные по Граму, лактофуксином, хлопчатобумажной синью, Романовскому-Гимзе) при малом увеличении, затем при х40. Лучшие результаты исследования дает фазово-контрастная микроскопия.

Первичную культуру возбудителей получают посевом патологического материала на агар Сабуро, сусло-агар, кровяной агар и др.(10-12 пробирок). При загрязнении посторонней микрофлорой можно применить предпосевную обработку патологического материала (70⁰ этиловым спиртом или 2-4%-ным раствором формалина 3-6 мин.) или добавить антибиотики в питательную среду. Оптимальный рН питательной среды для патогенных грибов составляет 6,0-7,2, температура культивирования 26-30⁰ С, для отдельных представителей 37⁰ С. Посевы выдерживают до 30 суток, так как первичные культуры чаще развиваются медленно (напр. Tr. verrucosum). Идентификацию культур проводят по культурально-морфологическим признакам, ферментативной активности на специальных средах. При микроскопии культур (непосредственно в чашках или препаратах) выявляют мицеальные тяжи, склероции, плодовые тела, строение и характер ветвления спорангиеносцев, конидиеносцев, форму спорангиев, расположение конидий (цепочками или одиночно), отношение к окраске. Патогенность культур проверяют заражением белых мышей, морских свинок, кроликов через скарифицированную кожу, подкожно, интраперитониально, внутривенно, ингаляционным методом. Серологические реакции (агглютинации, преципитации, РСК и др.), аллергические внутрикожные пробы применяют в комплексе с другими методами при диагностике преимущественно кандидамикоза, гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита. Люминесцентным методом выявляют у животных микроспорию.

Для микологического исследования при диагностике микотоксикозов берут средние пробы из партий кормов, вызвавших алиментарное отравление животных. Предварительно исключают инфекционные болезни, отравления ядовитыми растениями и ядохимикатами. Используют органолептический, микологический, токсико-биологический и физико-химический методы.

При органолептическом анализе учитывают влажность, цвет, запах, иногда вкус, а также видимые поражения корма грибами. Микологическое исследование включает: первичное выделение грибов из кормов, количественный учет и дифференциацию их, выделение чистых культур грибов. Выделение токсичных вариантов грибов из исследуемых образцов корма – решающий момент в диагностике микотоксикозов. Токсичность образцов корма и культур грибов определяют кожной пробой на кроликах, простейших (инфузориях стилонихиях) и скармливанием лабораторным животным. Физико-химический анализ заключается в изоляции, качественном и количественном определении в кормах и культурах грибов афлатоксинов, микотоксина (Т-2), зеараленона (Ф-2) путем тонкослойной хроматографии в сочетании с люминесцентной микроскопией.