Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине

За последние годы в области энзимологии достигнуто глубокое понимание физико-химической сущности биологического катализа, выявлены основы специфичности и стереоспецифичности действия ферментов, найдены механизмы регуляции таких важнейших свойств ферментов, как активность и стабильность. Широкое развитие методов химической модификации и иммобилизации белков, а также достижения современной биохимии и микробиологии дали возможность выделять практически любой фермент в нужном количестве и на его основе создавать необходимый гетерогенный катализатор. Благодаря этому, с начала 70-х годов ферменты стали находить применение в современной промышленности и медицине. Открылись широкие перспективы использования ферментов для анализа, в тонком органическом синтезе, в системах биоконверсии солнечной энергии и ряде других областей.

Инженерная энзимология – новое научно-техническое направление, основанное на принципах целого ряда областей современного естествознания, в первую очередь химической энзимологии, биохимии, химической технологии, а также инженерно-экономических дисциплин. Основная задача инженерной энзимологии – разработка биотехнологических процессов, в которых используется каталитическое действие ферментов, как правило, выделенных из состава биологических систем или находящихся внутри клеток, искусственно лишенных способности расти. К инженерной энзимологии относятся соответствующие научно-исследовательские и инженерные разработки, если они ставят своей целью: а) получение нового продукта; б) получение известного продукта, но лучшего качества; в) улучшение технико-экономических показателей процесса по сравнению с аналогичными существующими процессами. В основе современной инженерной энзимологии лежит применение иммобилизованных ферментов и ферментных систем.

Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности. Для получения иммобилизованных ферментов обычно применяют следующие методы:

1. Ковалентное присоединение молекул ферментов к водонерастворимому носителю, в качестве которого используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К первым относится целлюлоза, хитин, агароза, декстраны, бумага, ткани, полистирол, найлон, ионообменные смолы и т.д., ко вторым – пористое стекло, силикагели, силохромы, керамика, металлы и т.д.

2. Захват фермента в сетку геля или полимера.

3. Ковалентная сшивка молекул фермента друг с другом или с инертными белками при помощи би- или полифункционального реагента.

4. Адсорбция фермента на водонерастворимых носителях (часто на ионитах).

5. Микрокапсулирование (захват раствора фермента в полупроницаемые капсулы размером 5 – 300 мкм).

В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов – их можно удалять из реакционной смеси (и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией. Этим устраняется первый из перечисленных недостатков растворимых ферментов как технологических катализаторов. Более того, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонны или проточные аппараты с иммобилизованными ферментами.

Иммобилизованные ферменты оказались в целом значительно более устойчивыми к внешним воздействиям, чем растворимые ферменты. Таким образом, возникли перспективы преодоления и второго недостатка биокатализаторов – их лабильности.

Принцип иммобилизации был применен не только к ферментам, но и к их субстратам, ингибиторам и кофакторам, т.е. веществам, имеющим избирательное сродство к ферментам. Это позволило создать метод выделения и очистки ферментов, основанный на хроматографии по сродству, или аффинной хроматографии. Тем самым существенно облегчилось выделение чистых ферментов.

Благодаря высокой активности и специфичности некоторые ферменты уже давно нашли применение в ряде областей промышленности (табл. 1.1). В основном это пищевая промышленность, где применяются главным образом комплексные ферментные препараты для гидролиза природных полимеров – белков, крахмала, пектинов.

Таблица 1.1.1

Примеры использования ферментов в промышленности

Применение иммобилизованных ферментов и белков в медицине открывают новые перспективы создания эффективных лекарственных средств. Ферменты, закрепленные на носителях или модифицированные полимерами, зачастую снижают свою антигенность из-за уменьшения доступности их для рецепторов иммунной системы. На принципах иммобилизации физиологически активных соединений базируется приготовление ферментных препаратов типа «контейнер» и других, обладающих повышенным терапевтическим эффектом.

Интересные возможности были обнаружены при использовании ферментов для повышения чувствительности иммунохимических методов анализа. Сущность любого иммунохимического анализа сводится к тому, чтобы после завершения реакции антиген-антитело определить концентрацию избыточного компонента (антигена или антитела), не вступившего в реакцию. Поскольку эти концентрации очень невысоки (10^-12 – 10^-8 моль/л), для их обнаружения обычно применяют легко детектируемую метку радиоактивным атомом, вводимым в один из компонентов (радиоактивный йод, тритий). Оказалось, что без потери чувствительности метода радиоактивная метка может быть заменена присоединением фермента, который после реакции обнаруживается по его каталитической активности. С помощью иммуноферментного анализа могут быть детектированы любые вещества, обладающие свойствами антигенов и, естественно, многочисленные возбудители заболеваний человека, животных, растений. Многие из этих методов могут быть приспособлены к автоматическому режиму слежения, что важно для решения задач экологии, контроля технологических производств и т.д.

Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов

Энзимология долго не располагала строго научной номенклатурой ферментов. Наименования ферментам давали по случайным признакам (тривиальная номенклатура), по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента и, наконец, по типу катализируемой реакции и характеру субстрата. Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких ферментов, как пепсин (от греч. пепсис – пищеварение), трипсин (от греч. трипсис – разжижаю) и папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из сока которого он выделен). По действию все эти ферменты являются протеолитическими, т.е. ускоряют гидролиз белков.

Современные классификация и номенклатура ферментов были разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве. Необходимость систематики номенклатуры диктовалась, прежде всего, стремительным ростом числа вновь открываемых ферментов, которым присваивались разные названия. Более того, одному и тому же ферменту часто давали два или несколько названий, что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не отражали тип катализируемой реакции, а при наименовании фермента исходили из названия субстрата, на который действует фермент, с добавлением окончания -аза: в частности, амилазы (ферменты, гидролизируюшие углеводы), липазы (действующие на липиды), протеиназы (гидролизируюшие белки) и т.д.

В основу принятой классификации положен тип катализируемой реакции, который является специфичным для действия любого фермента. Этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов. В соответствии с решением Международной комиссии для каждого фермента установлен код, состоящий из четырех чисел, разделенных точками. Первое число означает, к какому из шести основных классов относится фермент; второе указывает подкласс (как правило, природу донора); третье – подподкласс (как правило, природу акцептора); четвертое число – это порядковый номер фермента в его подподклассе. Основными группами ферментов в настоящее время принято считать следующие классы:

1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. В названиях используются термины дегидрогеназа или редуктаза, а если акцептором является молекулярный кислород, то оксидаза:

1.1 – действуют на СНОН-группу доноров;

1.1.1 – акцепторами служат NAD⁺ или NADP⁺.

Таким образом, первый фермент этого класса – алкогольдегидрогеназа обозначается так: 1.1.1.1 Алкоголь: NAD оксндоредуктаза:

Этанол + NAD⁺ ® ацетальдегид + NADH.

2. Трансферазы, катализирующие перенос тех или иных групп, например аминотрансферазы:2.6.1.2 L-аланин-оксоглутарат аминотрансфераза:

Аланин + 2-оксоглутарат ® пируват + глутамат.

3. Гидролазы, катализирующие перенос групп на молекулу воды, например 3.1.2.1 Ацетил-СоА-гидролаза:

Ацетил-СоА + Н₂О ® ацетат + СоА.

4. Лиазы, катализирующие образование двойных связей или присоединение по двойным связям, например: 4.1.3.1 трео-О-изо-цитрат глиоксилат-лиаза (изоцитратлиаза):

Изоцитрат ® сукцинат + глиоксилат.

5. Изомеразы, катализирующие изменение геометрической или пространственной конфигурации молекул, например: 5.1.1.1 Аланинрацемаза:

L-аланин ® D-аланин.

6. Лигазы, катализирующие соединение двух молекул, сопровождающееся гидролизом богатой энергией связи, например: 6.2.1.1 Ацетат: СоА лнгаза:

Ацетат + СоА + АТР ® ацетил-СоА + AMP + пирофосфат.

Несмотря на общепринятые требования к обозначению названий ферментов в научной литературе (в соответствии с международной классификацией), нередко встречаются и старые, более простые названия ферментов.