Разрушение клеток и экстракция белков

Первым этапом выделения и очистки ферментов является разрушение клеток и экстракция белковых молекул. Для разрушения клеток используют различные методы – осмотический шок, растирание кусочков ткани с кварцевым песком или стеклянными шариками, размельчение гомогенизаторами различных типов (рис. 1.2.1). Метод разрушения клеток и время обработки выбирают в зависимости от типа ткани. Эритроциты обычно подвергают осмотическому шоку. Мягкие ткани (печень, мозг) разрушают с помощью гомогенизатора Поттера. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Для выделения белков, связанных с мембраной, используют детергенты. После экстракции белка гомогенат центрифугируют при 10000-20000 об/мин для удаления нерастворимого осадка. Полученная надосадочная жидкость (супернатант) называется экстрактом.

а б

Рис.1.2.1. Ультразвуковой гомогенизатор (а), магнитный гомогенизатор (б)

После получения экстракта, содержащего исследуемый фермент, его подвергают очистке. Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей. На каждой ступени разделения должна получаться фракция более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс часто называют фракционированием. На каждой стадии разделения белок находится либо в виде раствора, либо в виде осадка.

Диализ

Непосредственно перед очисткой ферментов белковые растворы концентрируют. Это можно осуществить методами: а) осаждения с последующим растворением в меньшем объеме; б) адсорбции на ионообменнике с последующей элюцией; в) ультрафильтрации. После или до концентрирования белковых препаратов проводят их диализ, в результате чего из образца с помощью полупроницаемой мембраны удаляются низкомолекулярные соединения, которые замещаются буфером. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через полупроницаемую мембрану, а неспособные диализировать коллоидные частицы остаются в ней (рис. 1.2.2). Простейший диализатор представляет собой мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая жидкость. Мешочек погружают в растворитель. Постепенно концентрация диализирующего вещества в диализируемой жидкости и растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа крайне низка. Для ускорения диализа увеличивают площадь мембраны, повышают температуру и осуществляют непрерывную смену растворителя. Экстракт, прошедший диализ, называю диализатом.

Рис. 1.2.2. Простейшая система для диализа