Химический состав карпа

Оборудование: сушильный шкаф, отрегулированный на 105°С, весы с точностью взвешивания до 0,1 г, эксикатор с прокаленным хлористым кальцием, сосуды для взвешивания емкостью порядка -50 мл (желательно использовать стеклянные и металлические стаканчики, чашки Петри).

Ход определения: сосуды нумеруют и взвешивают, рыбу измельчают ножницами, помещают в сосуд и взвешивают. Массы наполненного и пустого сосудов записывают.

Если штучная масса рыб до 10 г, то лучше анализировать каждую рыбу в отдельности целиком. Если рыба крупная, то следует получен­ный фарш хорошо перемешать и взять навеску порядка 10г.

Сосуды с навесками:

- ставят в сушильный шкаф на 24 ч,

- остужают в эксикаторе,

- взвешивают и массы их записывают,

- снова помещают в сушильный шкафна 24 ч,

- повторное охлаждение и взвешивание.

Если полученные показатели взвешивания хорошо совпадают (разница менее 1%), вычисляют содержание сухого вещества. Если масса сосуда с навеской продолжает уцениваться, сушку, охлаждение и взвеши­вание повторяют до тех пор, пока масса не перестанет понижаться или не начнет несколько повышаться.

Вычисление сухой массы:

масса сосуда с на- _ масса сосуда с на-

веской до сушки, г веской после сушки, г

Сухая масса, % = ------------------------------------------------------------*100

масса сосуда с на- _ масса сосуда, г

веской до сушки, г

Жирность рыбы. Содержание жира в теле рыбы определяется балансом питательных веществ и направлением метаболических процессов. Извест­но, что по мере роста рыба, как правило, становится жирнее, и норма жирности для нее меняется. Однако повышение жирности не всегда является показателем благополучия. Например, если в рационе карпа не хватает фосфора, то жирность его тела существенно превышает норму. У форели такого явления пока не обнаружено.

Показатели жирности тела по сравнению с нормой понижаются в результате голодания.

Жирность рыбы влияет на содержание сухого вещества в ее теле. Однако дело несколько осложняется тем, что зависимость между содер­жанием сухого вещества и жира в теле неодинакова для различных размерных групп рыб.

Что касается жирности печени, то как понижение, так и повышение этого показателя может служить неблагоприятным признаком.

Жирность и относительная масса печени могут повышаться вместе с отставанием в росте в результате нехватки незаменимых жирных кислот, зольных элементов, витаминов. В тепловодном хозяйстве нормальной считается высокая жирность тела и печени карпа, т.к. при этом наблюдается удовлетворительная скорость роста. Нормализация кормления может понизить жирность без снижения скорости роста. Закономерности жиронакопления растительноядных рыб исследованы недостаточно. Приведенные в табл. 50 данные можно принять за норму.

Таблица 50

Содержание жира в печени и мышцах растительноядных рыб

Оборудование и реактивы: весы аналитические, ступка фарфоровая с пестиком, колба Бунзена, воронка Бюхнера, насос Комовского, стаканчики на 50-100 мл, сушильный шкаф, ацетон, сульфат натрия безводный.

Ход определения: арбитражным методом определения жирности является метод Сокслета, однако он слишком длительный и в некоторых случаях, например, при анализе икры рыб, дает заниженные результаты. Ниже приводится метод, основанный на экстракции ацетоном и отгонке ацетона.

Сеголетков массой до 10,0 г анализируют целиком. Более крупную рыбу измельчают, фарш хорошо перемешивают и берут навеску 5-10 г с точностью до 0,1 г.

Предварительно рыбу необходимо обсушить фильтровальной бумагой, взвесить и записать массу.

Рыбу, помещенную в фарфоровую ступку, измельчают ножницами, добавляют приблизительно равное по объему количество безводного сульфата натрия и хорошо растирают пестиком до однородной массы. Если масса получается мокрая, то следует добавить еще некоторое ко­личество сульфата натрия. Можно также для ускорения кристаллизации воды и обезвоживания ткани поставить ступку на 1 ч в холодильник при температуре 4-6°С.

Сухую массу из ступки ложкой переносят в стакан и заливают2-3-кратным объемом ацетона. Стакан накрывают стеклом или пленкой для уменьшения испарения и оставляют на ночь для экстракции жира.

Содержимое стакана переносят ложкой на фильтр прибора для фильтрования. Прибор состоит из колбы Бунзена и воронки Бюхнера с хорошо пригнанным бумажным фильтром. Особенно удобно пользоваться специальным стеклянным фильтром в виде цилиндрической воронки с вваренной пористой стеклянной пластинкой. Отрицательное давление в колбе Бунзена создается насосом Комовского или водоструйным насосом. После того, как весь ацетоновый раствор жира стечет в колбу, стакан ополаскивают новой порцией ацетона и также пропускают его через воронку. Общий объем ацетона должен в 5-10 раз превышать количество взятой на анализ рыбы.

Ацетон переливаютиз колбы Бунзена в мерный цилиндр и записывают полученный объем. Из этого объема берут пипеткой 20-30 мл и наливают в предварительно взвешенный стаканчик.

Стаканчик с ацетоновым раствором жира выпаривают в сушильном шкафу до исчезновения запаха ацетона.

После отгонки ацетона стаканчик остужают в эксикаторе взвешивают. Для взвешивания стаканчика с жиром и без жира требуются точные аналитические весы (например, ВЛА-200), т.к. взвешивает­ся, как правило, не более 100 мг жира. Успех анализа прежде всего зависит от точности взвешивания.

Расчет жирности:

масса стакана _ масса пустого объем всего

с жиром, г стакана, г * ацетона, мл

Жирность, %-----------------------------------------------------------------*100

навеска рыбы, г * объем ацетона, взятого

для отгонки

Содержание белка в теле рыбы может меняться в зависимости от целого ряда причин. При истощении количество белка в теле уменьша­ется прежде всего из-за обводнения ткани. Но содержание белка может несколько уменьшаться и благодаря повышению жирности. Поэтому этим признакам следует пользоваться осторожно, учитывая другие по­казатели общего химического состава.

Определение белка. Арбитражным методом является метод Къельдаля, при котором навеску ткани сжигают в серной кис­лоте, определяют азот и по этому показатели судят о содер­жании белка в теле рыб. Метод Къельдаля требует навыка и акку­ратности. Более прост описываемый ниже метод определения белка «по разности». Поскольку рыба состоит на 70-90% из воды, 1-10% жи­ра, 1,5-3% минеральных веществ и 9-17% белка, то при наличии данных о сухой массе и жирности для определения белка достаточно сделать анализ на содержание в теле золы. Метод дает несколько завышенные данные (в среднем в 1,14 раза) по сравнению с методом Къельдаля, но т.к. ошибка будет постоянной, то получаемые результаты будут сравнимы и вполне приемлемы для практического рыбоводства. Расчет содержания белка, %:

Белок = сухое вещество - жир - зола

Довольно точно отражает содержание белка в теле карпа такжесо- держание сухого вещества. Для такого определения можно пользовать­ся результатами, представленными на графике.

Содержание золы в теле рыбы имеет возрастную динамику, которая заключается в повышении зольности по мере роста.

При истощении содержание золы в теле увеличивается. Низкое содержание золы в теле и в костях может указывать также на недостаток фосфора в рационе.

Содержание золы определяют весовым способом. Навеску помещают в взвешенный фарфоровый тигель, взвешивают и сжи­гают в муфельной печи 500-700°С. Сжигать можно навеску сухого вещества (порядка 0,5 г) или навеску сырого вещества (2-3 г). Сжи­гание производят до превращения ткани в светлую, иногда слегка окрашенную золу. Взвешивание проводят на аналитических весах.

Расчет содержания золы при сжигании сырого вещества:

(масса тигля с золой, г – масса пустого тигля, г)

Зола = ----------------------------------------------------------------- * 100%

навеска сырой ткани, г

Содержание гликогена в тканях рыб. Высокое содержание гликогена в организме рыб, особенно в печени, как правило, является благоприятным признаком. Однако повышенное содержание гликогена в печени может указывать на высокое содержание в кормах углеводов (табл.51).

Таблица 51

Содержание гликогена в тканях рыб, %

При высоком содержании гликогена в пробе определение проводят «прямым» методом. Если гликогена в пробе мало, что можно ожидать у истощенной рыбы, его предварительно осаждают спиртом – «непрямой» метод, т.к. цветную реакцию с антроном дают также продукты гидролизабелка.

Оборудование и реактивы: фотоэлектроколориметр, антрон - 0,2%-й раствор, приготовленный на 95%-ном растворе х.ч. серной кислоты (раствор готовят в день определения), глюкоза - стандартный раствор (1 мл содержит 40 мкг глюкозы); КОН – 30%-ный раствор; этиловый спирт.

Определение гликогена.

«Прямой» метод. В пробирки, содержащие 25-100 мг печени, добавляют 3 мл З0%-ного КОН, закрывают пробками и 20 мин выдерживают на кипящей водяной бане, охлаждают и разводят до 25-50 мл дистиллированной водой. 2 мл полученного раствора смешивают в пробирке с 4 млантронового реактива и в течение 10мин нагревают на кипящей водяной бане, затем охлаждают в холодной воде. Проявившуюся сине-зеленую окраску фотометрируют с красным фильтром (620 нм) против холостой про­бы (окраска стабильна при комнатной температуре в течение несколь­ких часов). Такую же цветную реакции проводят с раствором глюкозы разных концентраций для построения калибровочного графика. Между концентрацией и оптической плотностью сохраняется прямолинейная зависимость для концентраций глюкозы 0,1-1,5 мг/мл. Для расчета содержания гликогена найденное по калибровочному графику количество глюкозы делят на коэффициент 1,11, который отражает отношение молекулярного веса глюкозы к молекулярному весу глюкозного остатка в гликогене.

«Непрямой» метод. В центрифужную пробирку берут 25-100 мг ткани, добавляют 3 мл 30% КОН, нагревают 20 минна кипящей водяной бане. После охлаждения добавляют 4 мл этилового спирта, хорошо перемешивают и вновь нагревают в водяной бане, пока спирт не закипит. После охлаждения отделяют осадок гликогена центрифугированием в те­чение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок растворяют в 1 мл дистиллированной воды и снова повторяют осаждение равным объемом спирта. Осадок растворяют в 2 мл дистиллированной воды, добавляют 4 мл антронового реактива. Далее ход определения, как при «прямом» методе.

7.4. Анализ крови и печени

Гематологические методы рассчитаны на работу с небольшими количествами крови, кровяной плазмы, сыворотки. Гематологические по­казатели могут быстро изменяться в процессе отлова рыбы, ее транс­портировка, взятия крови и т.д.

Стрессовые и асфиксические явления приводят к накоплению в организме углекислота, молочной кислоты, глюкозы в крови, кортикоидных гормонов и адреналина, выбросу в кровь запасных эритроцитов, сопровождаемому повышением концентрации гемоглобина, разбуханию эритроцитов, гемолизу и изменению солевого состава плазмы крови. При быстро наступившем дефиците кислорода концентрация гемоглобина снижается. Поэтому желательно брать кровь у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10 мин. после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из анестетиков: пропоксат (0,6-0,8 мг/л), хинальдин (25-30 мг/л), серный эфир (1-1,5%). Вода, в которой нахо­дится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

Могут быть проведены следующие гематологические анализы:

- определение гематокрита (объема клеточных элементов в крови),

- оценка степени гемолиза (распада кровяных телец),

- определение общего количества сывороточных белков,

- определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)

- оценка осморезистентности эритроцитов (ОРЭ),

- определение количества гемоглобина в крови.

Техника взятия крови. Кровь можно брать несколькими способами: из сердца, жаберной вены, подкожной артерии, путем отсечения хвостового стебля (каудоэктомия).

Это зависит от размера объекта, необходимого количества крови, оснащенности и навыка. Для этой цели чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водными растворами антикоагулянтов: цитрата или оксалата натрия в концентрации 2 мг/мл, лучше гепарин - 1000 ед./мл или »8 мг/мл, 1 ед. сухого гепарина = 0,0077 мг. Например, выпускаемый в продажу раствор гепарина с исходной концентрацией 5000 м.е./мл разводят в 5 раз. Перед взятием крови прибегают также к ополаскиванию шприца и иглы прокипяченным 0,65% растворомNаСl. При любом способе взятия крови необходимо соблюдать определенные предосторожности: место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70^о спиртом и высушивают ватным тампоном для удаления слизи, богатой тромбокиназой. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты.

Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежевыпущенной, жидкой. Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь выпускают в подготов­ленные пробирки (или часовое отекло) осторожно по стенке.

Способы взятия крови.

Из сердца. Рыбу при помощи салфетки надежно фиксируют спиной вниз и вводят иглу (конец пастеровской пипетки), предвари­тельно проколов кожу препаровальной иглой, в точку: у форели - в се­редине линии, соединяющей основание грудных плавников, у карпа - несколько ближе к голове.

Иглу (пипетку) вводят под углом 30° относительно фронтальной плос-кости рыбы. При удачном попадании кровь поступает сразу же.

Из хвостовой вены. Рыбу фиксируют так же. Иглу (пипетку) вводят с брюшной стороны в точку за анальным плавником под углом 45° до упора в позвоночник. Легким движением вправо и влево прокаливают вену и набирают кровь путем осторожного подсасывания (при удачном попадании кровь сразу же появляется в капилляре).

Из подкожной артерии. Рыбу фиксируют на боку. Точка введения: у сеголетков приблизительно на 1-1,5мм ниже пересе­чения боковой линии и перпендикулярной к ней, мысленно опущенной от анального отверстия. У более крупных рыб - в точке пересечения от задней границы анального плавника.

Путем отсечения хвостового стебля. Это наиболее простой способ. Отсечению предшествует тщательная об­работка поверхности. Хвостовой стебель отрезается за анальным плав­ником острым скальпелем, ножом или ножницами во избежание размозжения тканей. Кровь собирают, держа рыбу головой вверх. Данный способ не исключает попадания в кровь тканей жидкости, вследствие чего результаты могут оказаться недостоверными. Учитывая это, для исследования берут 2-3-ю каплю.

Получение сыворотки крови. Взятуюкровь переливают в чистыесу­хие пробирки. Когда кровь свернется, отделяют сгусток от стенок пробирки путем обводки тонкой упругой проволочкой, конец которой погружен до дна. После этого для быстрого получения сыворотки кровь центрифугируют сразу же в течение 5 мин при 3 тыс.об./мин.

Сыворотку можно отделить и на следующий день в пробирках, оставленных в холодильнике при +4°С (при более долгом хранении насту­пает гемолиз). У карпа в норме сыворотка бесцветная или слабо желтоватая. Сыворотку отсасывают в чистые пробирки, которые можно хранить долгое время в морозильной камере холодильника. Закрывать пробирку удобно путем заклеивания квадратным кусочком лейкопластыря. Повторные замораживания и отстаивания сывороток не рекомендуются. В полевых условиях, где нет холодильника, для кратковременного хранения и доставки проб удобно пользоваться широкогорлым термосом со льдом.

Определение гематокрита. В организме может наблюдаться физиологическое или патологическое обезвоживание (сгущение) крови или, наоборот, ее разжижение. В обоих случаях в единице объема крови, соответственно, увеличивается или уменьшается содержание форменных элементов.

Оборудование и реактивы. Для гематокрита можно использовать либо специальную микрогематокритную центрифигу «МГЦ-8», либо микроцентри-фугу Шкляра, либо микрогематокритную насадку к лабораторной центрифуге «ЦУМ-1». Последняя представляет собой градуированный капилляр диаметром 1 мм, разделенный на 100 частей, монтируемый в металлическую оправу, насаживаемую на ось центрифуги.

Для обработки капилляров при определении гематокрита на центрифуге «МГЦ-8» применяется либо гепарин - 1000 ед./мл, либо раствор Геллера и Пауля: 1,2% оксалат аммония в смеси с оксалатом калия -0,8%. Трубочку предварительно следует прополоскать несколько раз раствором гепарина и высушить при комнатной температуре. Раствор Геллера и Пауля насасывают в трубочку и высушивают в сушильном шкафу при 60°С. Использование высушенного антикоагулянта имеет то преимущество перед жидким, что устраняет вычисления, связанные с разведением крови.

Ход определения. Гематокритная величина, или гематокрит выражает долю объема крови (%), занимаемую форменными элементами, и определяется центрифугированием крови сразу же после ее взятия в гематокритных трубочках или капиллярах, обработанных антикоагулянтом. При заполнении кровью в капиллярне должны попадать пузырьки воздуха. Заполнение гематокритной трубочки удобно проводить с помощью насасывания через подключенную к ней резиновую трубку подходящей длины и диаметра со стеклянным мундштуком.

Время вращения зависит от скорости. Центрифугируют до получения постоянного объема эритроцитов. Ориентировочно на «МГЦ-8» при 9000 об./мин, на «ЦУМ-1» при 6000 об./мин. - 5 мин. Ручку микроцентрифуги Шкляра вращают со скоростью 60-70 об./мин(насадка при этом вращается со скоростью 7000 об./мин). Кровь центрифугируют в течение 1 мин. Форменные элементы располагаются в периферических концах капилляра, а плазма - в центре. По делениям капилляра определяют соотношение между объемами плазмы и форменных элементов.

Согласно Международной системе единиц (СИ), показатель гематокрита выражается в л/л: 1 л/л - 100%. Например, по старой системе гематокритное число обозначается как 30%, по новой - 0,30 л/л.

Практические рекомендации. Если нет шприца, пастеровских пи­петок и гематокритных трубочек, то в полевых условиях проводят отбор проб, определение гематокрита, получение сыворотки и т.д. при помощи обычной инъекционной иглы и стандартной полихловиниловой трубочки от обычной шариковой (трубочка длиной 100мм со стандартным внутренним диаметром 2 мм имеет объем 0,3 см³). Предварительно из стержня шариковой ручки с помощью пинцета вынимает лагунный пишущий элемент, служащий в дальнейшем в качестве пробки. Трубку очищают смоченными спиртом сменяемыми ватными тампончиками, обвертываемыми вокруг конца упругой проволочки диаметром около I мм. Канал пишущего элемента освобождают с помощью заостренных палочек и затем плотно закрывают тонкой конусной пробкой, вырезанной из стенки подходящей полиэтиленовой пробки (например, бутылочной). Выступавший конец срезают вровень с краями пишущего элемента. Канал можно заполнить эпоксидной смолой или пластилином. Для взятия крови любым из указанных способов на конец очищенной трубочки (лучше тот, откуда изъят пишущий элемент) одевают иглу со сточенным под углом 45° (можно на бруске) концом для лучшего попадания в кровеносный сосуд с последующей обработкой раствором антикоагулянта. Заполнить трубку кровью можно легко и без иглы, приставляя ее в наклонном положении к капле, образующейся на срезе после отсечения хвоста. После взятия крови, удерживая трубочку, как пипетку, снимают иглу и закрывают конец трубочки пробочкой, подготовленной указанным выше способом. Для определения гематокрита трубочку с кровью центрифугируют в горизонтальном положении. Для этого ее плотно вставляют в канал, перпендикулярный оси центрифуги, проделанный нагретым на пламени спиртовки (горелки) гвоздем в пробках из обычного мягкого пенопласта, вставленных предварительно в широкие гнезда ротора уг­ловой центрифуги. После центрифугирования при помощи штангенциркуля или линейки определяют расстояние от дна трубки до поверхности жидкости и от дна трубки до линии раздела осевших кровяных клеток. Отношение этих величин, выраженное в процентах, представляет собой гематокрит.

Например, высота столбика всей жидкости 14мм, высота столбика кровяных клеток 7мм, гематокрит = 7:14_*100 = 50%.

Полученную сыворотку можно отсосать с помощью другой чистой трубочки с иглой в пробирки, сделанные из обрезков трубочек путем заплавления их одного конца над пламенем спиртовки и последующего обжатия с помощью пинцета, либо, что удобнее, с использованием пробочек, изготовленных, как указано выше. Во избежание образования воздушной пробки конец иглы необходимо перед выпусканием крови опускатъ сразу додна.

Указанное приспособление очень удобно для работы с малыми количествами крови, получаемыми от рыб небольшого размера и молоди, т.к. тонкий диаметр трубки обеспечивает достаточную для отбора высоту столбика сыворотки, что практически невозможно при использовании широких пробирок. При необходимости стерженьможно укоро­тить.

Оценка гемолиза При различного рода заболеваниях воздействиях в крови наблюдается гемолиз - распад эритроцитов и выход из них красного пигмента гемоглобина. В этих случаях сыворотка бывает окрашенной с различной интенсивностью в цвета от слегка розоватого до красного в зависимости от степени гемолиза. Для внесения объективного признака степени гемолиза рекомендуется следующий цветной стандарт. Кровь от здоровой рыбы (содержание Нв 8-10г%) смешивают дистиллированной водойв соотношении 1:4 для получения гемолизированной жидкости, которуюзатем разводят в уленгутовских пробиркахвсоотношениях,приведенных в табл. 52.

Степень гемолиза выражают в крестах с указанием цвета по стандарту, либо в абсолютных величинах содержания гемоглобина в цветном стандарте, приготовленном из крови с содержанием Нв - 9,0 г%.

Полученную указанным выше способом сыворотку осторожно отсасывают пипеткой, помещают в уленгутовскую пробирку того же диаметра, что и пробирки в цветном стандарте. Затем просматривают столбик сыворотки в исследуемой пробирке параллельно с каждым цветным стандартом на просвет перед белым листом бумаги и устанавливают степень гемолиэа в %. Эта же сывороткаможет быть использована для определения общего содержания белка.

Таблица 52