С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Методы исследования наследственного материала (нуклеиновых кислот) постоянно совершенствуются, при этом для анализа структуры ДНК требуется определённое количество клеточного материала. Например, даже при использовании такого высокочувствительного метода, как фингерпринт ДНК т. е. высокоспецифичных гибридизационных полос на электрофореграммах, образующиеся как результат полиморфизма длины рестрикционных фрагментов геномной ДНК, требовалось наличие капли крови или другого эквивалентного количества образца животной или растительной ткани, содержащих в клетках достаточное для анализа количество копий ДНК.

Сегодня ситуация радикально изменилась благодаря появлению метода, который был разработан Кэри Мюллисом. Этот метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР) и стал неотъемлемой процедурой, освоенной во всех генно-инженерных лабораториях мира. Использование методики ПЦР позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или её фрагмент in vitro, увеличивая количество копий в миллионы раз за несколько часов.

ПЦР осуществляют в пробирке с помощью специального термостабильного фермента ДНК-полимераза (Tag-полимераза), набора всех четырёх нуклеотидов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров. Праймеры – это короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов, одноцепочные фрагменты ДНК, комплементарные 3’-концевым последовательностям копируемой ДНК-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент ДНК, который будет скопирован Tag-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3’- концам праймеров и достраивающей их до заданной длины. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) протекает в три стадии (рис. 8.16).

Рис. 8.16. Последовательность стадий размножения фрагмента ДНК

1. Денатурация. Инкубационную смесь, в которой содержится образец нужной ДНК, нагревают до температуры 90°С. При этом, в течение 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двуцепочной молекулы образуются две одноцепочные.

2.Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50°С. При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами. Эта стадия обычно протекает 30 секунд.

3. Полимеризация. Инкубационную смесь нагревают до температуры 70°С. При этой температуре Tag-полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Этот процесс протекает в течение 90 секунд. В результате количество ДНК удваивается.

Фермент Tag- полимераза был выделен из термофильных бактерий Thermus aguaticus, отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70°С гибрид праймер ДНК не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью. За 20 циклов амплификации количество копий ДНК достигает величины 10⁶.

В последние годы удалось создать специальный прибор – амплификатор, с помощью которого все три стадии размножения ДНК производятся автоматически, что превратило процесс ПЦР-амплификации конкретной последовательности ДНК в простую задачу.

За разработку метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1993 году Кэри Мюллис был удостоен звания лауреата Нобелевской премии.

ПЦР-технологии позволили учёным без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. Одним из важнейших применений ПЦР стала диагностика наследственных заболеваний человека, особенно на пренатальных стадиях развития при наличии малого количества ДНК из фетальных клеток.

Важным применением ПЦР-технологий стала дактилоскопия (идентификация индивидуумов), используя материал ДНК, полученный из нескольких сперматозоидов, одного волоса или бластомера, выделенного из зародыша (эмбриона) на стадии восьми зародышевых клеток.