Количественные методы -титрование бактериофагов.

1.Титрование бактериофагов на плотной питательной среде по Грациа.

Для титрования необходимы следующие компоненты:

1) Пробирки с различными разведениями бактериофага с полужидким агаром

2) ряд чашек Петри с МПА;

3) суточная бульонная культура чувствительная к фагу бактерий (E. сoli, S.aureus или др.тест-культуры).

Смешивают разведения фага с суточной бульонной культурой и выливают на поверхность МПА в чашку Петри, где она застывает в виде тонкой плёнки, в которой неподвижно фиксированы бактерии. Чашки инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24часов. При этом незаражённые бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется. В результате на сплошном бактериальном газоне появляются четко очерченные зоны лизиса – негативные колонии.Число негативных колоний равно количеству жизнеспособных фаговых частиц в засеянной смеси.

Титр фага определяют по последней чашке, где появляются негативные колонии, то есть титром фага называется то максимальное разведение, при котором появляются негативные колонии.

2.Титрование бактериофага в жидких средах по Аппельману.

В 9 пробирках приготавливают десятикратные разведения исследуемой суспензии фага с МПБ. В качестве контроля берут МПБ без бактериофага. Во все пробирки добавляется по несколько мл культуры бактерий, например, E.сoli. Засеянные пробирки помещаются в термостат на 24 часа при 37⁰ С, после чего отмечаются результаты опыта. Титром бактериофага называется то наибольшее его разведение, при котором наблюдается полный лизис бактерий (бульон остается прозрачным).

57. Использование бактериофагов в микробиологии и медицине. Реакции фаготипирования и фаголизиса.

Фаги используют в диагностике инфекционных болезней: с помощью известных (диагностических) фагов проводят идентификацию выделенных культур микроорганизмов. Вследствие высокой специфичности фагов можно определить вид возбудителя или варианты (типы) внутри вида.

Фаготипирование позволяет установить источник и пути распространения инфекции; – с помощью тест-культуры можно определить неизвестный фаг в исследуемом материале, что указывает на присутствие в нем соответствующих возбудителей.

Фаги применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней. Производят брюшнотифозный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый фаги и комбинированные препараты. Способы введения в организм: местно, энтерально или парентерально.

Реакция фаголизиса

Реакция фаголизиса применяется для идентификации выделенной чистой культуры бактерий по фагочувствительности. Реакцию ставят в двух пробирках: №1 (опыт) и №2 (контроль). Реакция фаголизиса изучаем на примере идентификации выделенной чистой культуры S.sonnei из испражнения при подозрении на дизентерию.

Посевы инкубируют в термостате 18-24 часов при 37⁰ С.

При наблюдении за посевами впервые часы бульон в пробирках слегка мутнеет вследствие размножения бактерий.

В дальнейшем в контрольной пробирке (без бактериофага) помутнение усиливается; в пробирке с бактериофагом через 6 часов происходит просветление в результате лизиса бактерий. Учет реакции проводятся по просветлению МПБ в результате лизируещего действия монофага на бактерии.

Реакция фаготипирования S.aureus

Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Реакция фаготипирования применяется с целью установления источников и путей передачи инфекции при госпитальных, кишечных заболеваниях и пищевых отравлениях.

Испытуемую суточную бульонную культуру S.aureus равномерно распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18-24 часа при температуре 37°С.

На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который вызывает её полный лизис. Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).