Определение активности каталазы картофеля (по А.Н. Баху и А.И. Опарину)

Оборудование: бюретка на 25 мл – 1 шт., пипетки мерные на 5 мл, 10 мл – по 1 шт., мерный цилиндр на 25 мл – 1 шт., мерная колба на 100 мл – 1 шт., стеклянная воронка – 1 шт. (для заполнения бюретки), конические колбы на 250 мл (или на 100 мл) – 1 шт., бумажные фильтры «белая лента», фарфоровая ступка с пестиком – 1 шт., весы – 1 шт., держатель для пробирок –1 шт., скальпель – 1 шт., ножницы – 1 шт., чашка Петри – 1 шт., стеклянная воронка – 1 шт. (для фильтрования).

Реактивы: свежий растительный материал (морковь, картофель, капустный лист, груша или др.) – 1 шт., карбонат кальция (порошок для снижения кислотности клеточного сока), песок кварцевый (для измельчения растительного материала в фарфоровой ступке)

0,1 н. раствор перманганата калия, 0,1 н. раствор пероксида водорода, 10% раствор серной кислоты, активированный уголь (для удаления пигментов добавляют к содержимому мерной колбы с экстрактом), раствор щавелевой кислоты.

Ход работы.2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и дово­дят водой до 100 мл.

Смесь оставляют стоять в течение 20-60 мин., после чего её фильтруют. В коническую колбу на 200 мл берут пипеткой 12 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляют туда же пипеткой 10 мл вытяжки фермента. Через 20 мин. действие фермента прекращают прибавлением 3 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин. розового окрашивания). Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося пероксида водорода.

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин. ферментным раствором (10 мл). К этому раствору после охлаждения добавляют 12 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода. Смесь оставляют стоять на 20 мин., после чего добавляют 3 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование всего количества пероксида водорода. По разности между опытным и контрольным титрованием находят коли­чество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчёты. Расчёт количества пероксида водорода, разложенного ферментом, ведут в соответствии с уравнением реакции:

5H₂O₂ + 2KMnO₄ + 3H₂SO₄ → 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 5O₂ + 8H₂O,

согласно которому 1 мл 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчёта: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объёмом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной – 30,2 мл 0,1 н. раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2-15,5) – 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7-1,7) 24,99 мг. В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 20 мин. разложить = 99,96 мг пероксида водорода, а за 1 мин. – (99,96:20) 5,00 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (5,00:0,034)·100 Е каталазы. Результат: 1,5∙10³ Е.

_______________________________________

Для удаления загрязнений перманганатом калия со стеклянной посуды применяют раствор щавелевой кислоты.