Определение влияния ионов металлов на активность каталазы

Каталазная активность наблюдается почти во всех животных клетках и органах. Эта активность также обнаруживается во всех растительных материалах и в большмнстве микроорганизмов, кроме облигатных анаэробов.

Каталаза – оксидоредуктаза, действующая на H₂O₂ в качестве акцептора. Она является сложным ферментом, состоящим из белкового комплекса и простетической группы, содержащей железо. Каталаза расщепляет перекись водорода на молекулярный кислород и воду:

каталаза

2H₂O₂ ––––––––® O₂ + 2H₂O

Одна молекула каталазы может разложить 44000 молекулы H₂O₂ в секунду (Ершов, 2003). Предлагаемый метод определения активности каталазы основан на учете количества разложившегося пероксида водорода под действием ферментного препарата методом титрования перманганатом калия.

Оборудование: бюретка на 25 мл – 1 шт., пипетки мерные на 5 мл, 10 мл 25 мл – по 1 шт., мерный цилиндр на 25 мл – 1 шт., мерная колба на 100 мл – 1 шт., стеклянная воронка – 1 шт., конические колбы на 250 мл (или на 100 мл) – 1 шт., бумажные фильтры «белая лента», фарфоровая ступка с пестиком – 1 шт., весы – 1 шт., держатель для пробирок – 1 шт., скальпель – 1 шт., ножницы – 1 шт., чашка Петри – 1 шт., стеклянная воронка – 1 шт. (для заполнения бюретки).

Реактивы: 3% раствор перекиси водорода, активированный уголь (для удаления пигментов добавляют к содержимому мерной колбы с экстрактом), песок кварцевый (для измельчения растительного материала в фарфоровой ступке), 0,1 н. раствор перманганата калия, 10% раствор серной кислоты, карбонат кальция (порошок для снижения кислотности клеточного сока), 0,1 М раствор сульфата меди (II) CuSO₄, 0,1 М раствор ацетата свинца (II) Pb(CH₃COO)₂, 0,1 М раствор сульфата железа (III) Fe₂(SO₄)₃ (или хлорида железа (III), свежий растительный материал (морковь, картофель, капустный лист, груша или др.) – 1 шт., раствор щавелевой кислоты.

Ход работы.Навеску 2 г свежего растительного материала растирают в ступке с песком и 0,3 г СаСО₃, затем добавляют 20 мл воды и снова тщательно растирают до получения однородной массы. После этого растертую массу водой количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки.

Через 20-40 минут смесь фильтруют. Три порции чистого фильтрата (по 10 мл) помещают в колбы на 100 мл. В одну колбу добавляют 1 мл раствора соли тяжёлого металла, а в третью – 1 мл воды (данную пробу кипятят в течение 5 мин. на водяной бане, а затем охлаждают до комнатной температуры).

Во все колбы приливают по 10 мл воды и по 1,5 мл 1%-ного раствора перекиси во­дорода. Время инкубации от 20-30 минут. По оконча­нии инкубации к содержимому всех колб добавляют 3 мл 10%-него раствора H₂SO₄ и титруют 0,1 н. раствором KMnO₄ до слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение минуты.

Расчёты. По разности между контрольным и опытными титрованиями определяют количество разложившейся перекиси водорода за время инкубации в расчете на 1 г исходного растительного вещества.

,

где: c – активность каталазы в миллиграммах Н₂О₂, разложившейся за время инкубации на 1 г растительного вещества;

а – миллилитров 0,1 н. раствора КМnO₄, израсходованного на холостое титрование;

б – миллилитров 0,1 н. раствора КМnО₄, пошедшего на опытное титрование;

Т – поправка к титру 0,1 н. КМnO₄;

1,7 – количество миллиграммов H₂O₂, соответствующее каждому миллилитру 0,1 н. КмnO₄;

Н – навеска растительного материала.

Оцените влияние различных ионов на активность каталазы. Сделайте выводы.

_______________________________________

Для удаления загрязнений перманганатом калия со стеклянной посуды применяют раствор щавелевой кислоты.