Получение препарата уреазы (карбамидамидогидролаза; КФ 3.5.1.5)

Уреаза (от греч. ούρον – моча и -аза – стандартный аффикс биохимической номенклатуры, указывающий на принадлежность вещества к классу ферментов) – гидролитический фермент из группы амидаз, обладающий специфическим свойством катализировать гидролиз мочевины до углекислого газа и аммиака: CO(NH₂)₂ + H₂O → CO₂ + 2NH₃.

Уреаза обнаружена в бактериях (например, у руробактерий), дрожжах, растениях (особенно много её содержится в семенах сои), а также у ряда беспозвоночных; в клетках животных, у которых в качестве основного продукта азотистого обмена образуется мочевина, уреаза отсутствует. В организме человека и животных уреаза образуется бактериальной флорой. В 1926 году американский биохимик Джеймс Самнер доказал, что уреаза – это белок.

Оборудование: фарфоровая ступка с пестиком – 1 шт., водяная баня автоматическая – 1 шт., центрифуга – 1 шт., держатель для пробирок – 1 шт., мерные пипетки на 5 мл, 10 мл – по 1 шт., держатель для пробирок – 1 шт., кофемолка – 1 шт., воронка Бюхнера – 1 шт., коническая колба на 500 мл – 1 шт., колба для фильтрования под вакуумом (колба Бунзена) – 1 шт., насос для фильтрования под вакуумом – 1 шт., мерный цилиндр на 25 мл – 1 шт., бумажные фильтры «белая лента», стеклянная палочка – 1 шт., весы – 1 шт., скальпель – 1 шт.

Реактивы: бобы сои (заранее измельчённые и подготовленные для фильтрования экстракта уреазы из раствора), диэтиловый эфир, 1% раствор мочевины, спиртовой раствор фенолфталеина, 10% раствор гидроксида натрия, реактив Несслера.

Ход работы.10 г сухих бобов сои дважды размалывают на кофейной мельнице и тщательно растирают в ступке. Муку всыпают в коничес­кую (500 мл) колбу и встряхивают в течение 10-15 мин. с 20 мл диэтилового эфира для обезжиривания (колбу не закрывать пробкой, беречь от огня!). Осадок отделяют на воронке Бюхнера. Экстракцию эфиром повторяют 5-6 раз. Обезжиренную муку высушивают, распределяя её тонким слоем на стекле или фильтровальной бумаге. Высушенную, обезжиренную муку хранят в банке с притертой пробкой, предпочтительно в сухом месте. Она может долго храниться и затем служить для получения активных вытяжек уреазы.

10 г обезжиренной соевой муки настаивают с пятикратным количеством дистиллированной воды в течение 15-20 ч. при температуре не выше 5°С (в холодильнике). Осадок отделяют центрифугированием при 3000 g. Уреаза хорошо растворяется в воде, поэтому содержится в водной фазе.

Для проверки активности уреазы готовят 0,01%-ный раствор препарата. В пробирку наливают 5 мл 1%-ного раствора мочевины, 2-3 капли спиртового раствора фенолфталеина и 1-2 мл 0,01%-ного раствора уреазы. Пробирку помещают в термостат или водяную баню при 38°С на 30 мин. Параллельно ставят такой же опыт с прокипяченным раствором уреазы. Содержимое первой пробирки становится малиново-красным вследствие смещения реакции среды в щелочную область в результате образования аммиака. Образование аммиака можно обнаружить и иным путем. С этой целью повторяют опыт и после инкубации при 38°С в реакционную смесь осторожно добавляют равный объем 10%-ного раствора гидроксида натрия. Выделение аммиака обнаруживают по запаху, по посинению влажной лакмусовой бумажки у отверстия пробирки, а также по образованию красно-бурого осадка при добавлении 2-3 капель реактива Несслера.

Гидролиз мочевины, катализируемый уреазой, приводит к образованию оксида углерода (IV) и аммиака:

Свойства ферментов

Оборудование: фарфоровая ступка с пестиком – 1 шт., центрифуга – 1 шт., водяная баня автоматическая – 1 шт., держатель для пробирок – 1 шт., мерные пипетки на 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл – по 1 шт., держатель для пробирок – 1 шт., мерный цилиндр на 50 мл – 1 шт., вата (для фильтрования слюны), весы – 1 шт., скальпель – 1 шт., пластиковые одноразовые стаканы (для слюны) – 1 шт.

Реактивы: дрожжи пекарские сырые, прессованные – 1 пачка, песок кварцевый (для измельчения дрожжей в фарфоровой ступке), 5% раствор сахарозы, фелингова жидкость, раствор разбавленной слюны, 1% раствор сульфата меди, 10% раствор гидроксида натрия, 0,3% раствор иода в3%-ном растворе иодида калия или 0,1 н. раствор иода, молоко коровье, 0,4% раствор формальдегида, 0,01% раствор метиленового синего, масло вазелиновое.