Опыт 3. Обнаружение в молекулах белков пептидных связей (биуретовая реакция)

К 1-2 мл разбавленного белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия, хорошо перемешивают и добавляют 2-3 капли 1%-ного раствора сульфата меди. Снова тщательно перемешивают. Разви­вается красно-фиолетовое окрашивание. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щёлочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоёв появляется фиолетовое кольцо.

Механизм биуретовой реакции следующий.

Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп. Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизованными пептидными группами глутатиона или любого другого полипептида:

Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской (максимум поглощения в пределах 520-535 нм). В случае образования медных комплексов при участии трёх или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая и синяя (с максимумами поглощения в пределах 540-580 нм и 615-670 нм соответственно). Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.