Биосинтез аминокислот. Синтез белка.

Трансляция осуществляется в клетках при помоши сложной белок-синтезируюшей системы. Отдельные компоненты этой системы ассоциируют в единую структуру по мере ее функционирования и разобщаются по окончанию синтеза. В состав белокеннтезирующей системы входят следующие структуры:

• рибосомы — нуклеопротеины, содержащие примерно 60% рибосомаль-ной РНК и 40% различных белков;

• матричная РНК;

• транспортная РНК;

• белковые факторы и ферменты инициации, элонгации и терминапии трансляции;

• набор аминокислот;

• набор аминоацил-тРНК-синтетаз, образующих аминоацил-тРНК;

• макроэрги АТФ и ГТФ;

ионы Mg2\ Са2 Субстратами матричного синтеза белка являются аминокислоты, соединенные с тРНК, причем последние способствуют переводу информации с последовательности нуклеотидов на последовательность аминокислот. Транспортные РНК представляют собой олноцепочечные молекулы сравнительно небольшой молекулярной массы (22— 26 kDa) и состоящие из 80—100 нуклеотидов. Каждой аминокислоте соответствует от одной до шести транспортных РНК, с которыми она может образовывать комплекс Большая часть пула аминокислот в цитоплазме клеток находится не в свободном состоянии, а в виде амипоацил-тРНК. Это предохраняет аминокислоты от метаболических превращений и способствует сохранению набора аминокислот для синтеза белка. Образованию комплекса аминокислота-тРНК предшествует активация аминокислоты и нахождение соответствующей тРНК (рекогниция). Это происходит под действием фермента аминоацил-тРНК-син-тетазы, или АРС-азы. Эти ферменты имеют два активных центра, один из которых соответствует определенной тРНК, а другой строго специфичен соответствующей аминокислоте. Таким образом, в клетке должно быть не менее 20 АРС-аз, хотя фактически их несколько больше. Образование амино-ацил-тРНК происходит в лва этапа, первым из которых является взаимодействие аминокислоты (Ак) с макроэргом АТФ Аминоациладенилат (Ак~АМФ) остается в комплексе с АРС-азой до присоединения ко второму активному центру фермента тРНК. При взаимодействии комплекса (Ак-АМФ)-АРС-аза с тРНК образуется амипоацил-тРНК (Ак-тРНК); при этом выделяется свободный фермент и АМФ Трансляция осуществляется на рибосомах — своеобразных молекулярных машинах, функционирующих в цитоплазме и ориентированных на биосинтез всех видов белковых макромолекул. Рибосомы удерживают в функциональном состоянии многокомпонентную бслок-синтезирующую систему, а также обеспечивают точность считывания и реализации генетической информации. Они обладают каталитическими свойствами, образуя пептидную связь, а также выполняют функцию механического переноса псптидил-гРНК. Кроме основных функций — синтеза белка, — рибосомы регулируют собственный биогенез и ряд других метаболических процессов, например аминоацилированис тРНК. Рибосомы прокариот состоят из двух субчастиц, отличающихся по размеру. Малая субчастица имеет коэффициент седиментации 30S (1 молекула рРНК и 21 тип белков), а большая — 50S и состоит из двух молекул рРНК и 34 различных белков. В функциональном состоянии субчастицы ассоциируют, образуя полную 70S рибосому. У эукариот размеры частиц рибосом составляют: малая — 40S (около различных белков), большая — 60S (порядка 50 белков), а полная рибосома — 80S Элонгация представляет собой образование и удлинение полипептидной цепи, формирующейся на рибосоме. Этот процесс проходит при участии ГТФ и трех факторов элонгации. Эти факторы у прокариот имеют обозначения: EF-T, EF-T и EF-G, или просто: Т., Т и G. Фактор элонгации Т.. образует комплекс с ГТФ, который связывается со всеми аминоацил-тРНК в цитоплазме. Тройной комплекс, содержащий аминоацил-тРНК, с антикодоном, комплементарным кодону в А-пентре, также (Ти— ГТФ) перемешается в А-центр полной рибосомы, где происходит соединение кодона мРНК с антикодоном гРНК. Т обладает ГТФ-азной активностью и гидролизует ГТФ.

После этого Ти, ГДФ и Р, удаляются из рибосомы и исходный комплекс регенерирует при помощи Ts и ГТФ. Что касается комплекса тРНК— мРНК в А-нентрс, то точность кодон-антикодонового взаимодействия проверяется за счет соответствия (или несоответствия) дополнительных контактов в определенных сайтах молекул тРНК и ад РНК.

Таким образом, в пентидильном центре локализуется формилметионин-тРНК, а в аминоацилыюм — тРНК, соединенная со следующей после ме-тионина аминокислотой.

Следующим этапом элонгации является гидролиз сложноэфирной связи, перенос формилметионина из Р-иентра в А-центр и образование пептидной связи. Этот процесс осуществляется при помощи фермента транспептидазы, входящей в состав 50S рибосомальной субъединицы. Таким образом, в А-нентре образуется дипептид, соединенный с тРНК, а в пентидильном — свободная тРНК'Мс'. Затем рибосома перемещается на один колон мРНК в направлении 5'-* 3', при этом комплекс тРНКдипептид перемешается в Р-цснтр, а в освободившийся А-центр попадает третий колон мРНК. Находившаяся до этого в Р-центре тРНК|Ме1 отделяется от рибосомы и уходит в цитоплазму. Перемещение рибосомы по цепи мРНК происходит с помощью третьего фактора элонгации TF-G и требует затраты энергии ГТФ. Таким образом, завершается цикл элонгации, и белок-синтезирующая система готова к образованию следующей пептидной связи.

Терминация представляет собой завершение синтеза полипептидной цепи и освобождение ее от рибосомы. Сигналами, определяющими окончание синтеза, являются стоп-кодоны на цепи мРНК. Таких стоп-кодонов у прокариот три: УАА, УАГ, У ГА. У этих кодонов нет комплементарных антикодонов тРНК, поэтому при достижении их рибосомой синтез прекращается. В А-центр вместо аа-тРНК входят белковые факторы терминации RF, и RF, а также фактор RRF (Ribosome release factor).

Пол действием релизинг-фактора, соединенного с ГТФ и пептидилтранс-феразой, в Р-центрс гидролизустся связь тРНК-полипептид, причем последний освобождается из рибосомы. Кроме отделения полипептидной цепи, происходит освобождение мРНК от рибосомы, которая вновь готова к трансляции.

У эукариот синтез белка протекает в основном так же, как и у прокариот, хотя и имеются некоторые различия. Например, у эукариот рибосомы имеют больший размер, у них больший ассортимент белков и белковых факторов (около 10). Нацепи мРНК прокариот может синтезироваться несколько полипептидных испей, тогда как у эукариот — только одна полипептидная цепь, так как транскриптон эукариот синтезирует всего одну мРНК.

Различия в механизмах трансляции в основном касаются процессов инициации трансляции.

Различают четыре этапа инициации.

* Диссоциация рибосомы на 40S- и 60S Ч'убъединицы. Присоединение к 40 Sсубъединице инициирующих факторов IF-3 и IF-1 А, препятствующих реас-социапии 40S- и 60S-субъединиц в полную рибосому.

* Образование тройного комплекса, состоящего из Met-тРНК, ГТФ и IF-2, Затем этот комплекс взаимодействует с 40S-субъединицей рибосомы, в результате образуется преипициирующий комплекс. Образование премниии-ируюшего комплекса протекает в несколько стадий. Сначала происходит связывание ГТФ с IF-2. Этот двойной комплекс соединяется с Mct-тРНК и с инициирующим колоном мРНК АУГ. Образованный четырехкомпонентиый комплекс соединяется с 408-субъедипиией рибосомы, в результате получается 43S преинициируюший комплекс, который стабилизируется при помощи IF-3 и IF-1 А. Одной из важнейших структур, регулирующих синтез белка на стадии инициации, является белковый фактор IF-2. Он состоит из трех субъединиц (а, П и у), причем регулятор ной является а-субъединица, которая фосфорили-руется по серину 51.

* Связывание мРНК с 43S преинипиирующим комплексом и образование 48S инициирующего комплекса.

Комбинирование 48S инициирующего комплекса с 608-субъедииицей рибосомы и образование 80S инициирующего комплекса. В процессе образования полной рибосомы при помощи IF-5 происходит гидролиз ГТФ, связанного с IF-2. Эта реакция освобождает все факторы инициации, связанные с 48S инициирующим комплексом, и осуществляет быструю ассоциацию 40S-и 605-субъединиц в 80S полную рибосому с Mct-тРНК, расположенной в Р-сайте.

Синтез белка процесс, протекающий со значительной затратой энергии. Легко подсчитать число макроэргов, которые расходуются на образование одной полипептидной связи. При активации аминокислот АТФ гидролизуется до АМФ, что эквивалентно затрате двух макроэргов, а инициация трансляции требует один макроэрг ГТФ. В процессе элонгации затрачивается два макроэрга ГТФ: один на доставку' аминоацил-тРНК в А-центр рибосомы, а второй -на процесс Транслокации. И наконец, па термииаиию требуется один макро-эрг ГТФ.

Что же происходит с полипептидной цепью после освобождения ее из рибосомы?

Еще на рибосоме начинается процесс частичного формирования вторичной структуры белка. После образования 25—30-членного полипе пиша /V-конец выхолит из рибосомы и процесс скручивания белка продолжается вне ее. Это придает структуре жесткость, необходимую для пересечения мембран эпдоплазматического ретикулума Процесс закручивания иолипептилпой испи происходит при помощи специальных белков — шаниронов. При синтезе мембранных и секреторных белков, начиная с jVконца полипептидной цепи, от 10 до 30 аминокислотных остатков образуют сш нальную последовательноегь, состоящую из гидрофобных аминокислот. В клетках существуют свободные и мембранно-свя-занные рибосомы, причем связывание их с мембраной ЭР определяется в основном сигнальной последовательностью растущего полипептида. В мембранах ЭР найдены два гликопротсина, получившие название рибофорины, которые специфически соединяются с сигнальной последовательностью полипептида. Это присоединение имеет более сложный характер. Оказалось, что в питоплазме присутствуют специальные сигналузиаюшие структуры (СУС), представляющие собой 11S рибонуклеопротеины. Они взаимодействуют с сигнальной последовательностью растущего полипептида, при этом элонгация временно прекращается. Синтезирующийся полинептид с СУС присоединяется к рибофоринам в мембране ЭР; при этом образуется мембранный канал, который иногда называют трапелоконом. Элонгация возобновляется, но теперь она сопряжена с перемещением пептида через мембрану ЭР. После завершения синтеза полипентидной цепи под действием иротеазы, которая носит название сигналаза, сигнальная последовательность отщепляется, а новосинтезированный белок подвергается поеттрапеляционным модификациям или проиессингу. Для большинства секреторных и мембранных белков процессинг сопряжен с транспортом через определенные компартменты. Так, гликозилирование и ограниченный иротеолиз начинаются уже в ЭР и продолжаются в аппарате Гольджи. Этот комнартмент состоит из 12—15 «тарелок», сложенных в стоику Сторона, ориентированная па ЭР, называется цис-стороной, а в направлении цитоплазматической мембраны — транс-стороной. Новосинтсзироваиные белки поступают на цис-сторону аппарата Гольджи и перемещаются на его транс-сторону, пересекая все тарелки, причем по мере движения происходит их химическая модификация. Эта модификация имеет огромное значение, так как она, в частности, определяет следование новосинтезированного белка к месту функционирования. Так, фосфорилированпые в определенном положении белки следуют в лизосомы, гликозилированныс белки, в зависимости от сайта гликозилирования и размеров углеводной цепи, могут встраиваться в мембраны или экспортироваться в другие ткани и органы. Кроме того, химическая модификация определяет свойства зрелых белков.

Аппарат Гольджи является своеобразным сортировочным депо, отделяющим нормальные белки от дефектных. Последние перемещаются в лизосомы ассоциированные с аппаратом Гольджи, где гидролизуются до аминокислот. Норматьные белки доходят до транс-стороны и попадают в секреторные гранулы, которые отделяются от аппарата Гольджи и диффундируют к цитонлазматиче-ской мембране.

Затем методом экзопитоза белки попадают во внеклеточное пространство.

Внутриклеточные белки синтезируются на свободных рибосомах. Они нэ имеют сигнальных последовательностей, однако в большинстве своем синтезируются в виде пробел ков. Некоторые из них после соответствующего про-цессинга функционируют в цитоплазме, другие импортируют во внутриклеточные органеллы. Кроме адресной модификации, существуют многообразные химические модификации и локальный протеолиз белков, необходимые для их полноценного функционирования. Такими модификациями могут быть фосфорилирование по гидроксильным группам аминокислот, метилирование, гидроксилирование, присоединение карбоксильных, сульфо- и ацетильных групп и др.

После определенного времени функционирования (для разных белков оно составляет от нескольких минут до нескольких недель и даже месяцев) белки подвергаются протеолитической деградации. Механизмы деградации различны, они зависят от типа белков, их расположения в том или ином ком-партменте и от протеолитического потенциала клетки или ткани. Например, в клетках свободные белки деградируют в два этапа. Функционирование белков связано, как правило, с изменением их структуры и релаксацией к исходному состоянию. По мере биологического действия накапливаются некоторые изменения структуры, которые релаксируются не полностью, в результате происходит старение белков. Изменение структуры является сигналом для атаки цитоплазматичеоких. сериновых протеииаз, которые разрывают полипептидные связи или вырезают некоторые аминокислотные последовательности. Частично деградированный белок поступает в лизосомы, где происходит его полная деградация. Иногда сигналом для прогеологической атаки служит присоединение к старому белку низкомолекулярпых полипептидов, например убиквитина Синтез белка — сложный, многостадийный процесс, зависящий от функционального состояния ДНК, РНК и непосредственно белок-синтезируюшей системы.

Поэтому механизмы регуляции скорости образования белка реализуются как в ядре, так и в цитоплазме. Из рассмотренного понятно, что в образовании полипептидной цепи участвуют все три типа РНК. Таким образом, транскрипция является одним из факторов, определяющих скорость белкового синтеза. Экспрессия генов увеличивает скорость транскрипции, репрессия — снижает.

Регуляция синтеза белка у эукариот. Это более сложный процесс, так как транскрипция и трансляция происходят в разных компартментах и обеспечиваются большим количеством соответствующих структур.

На уровне транскрипции регуляторные механизмы у прокариот и эукариот имеют ряд общих черт. Рассмотрим некоторые отличительные особенности. Для клеток эукариот характерна амплификация генов и их перестройка. Оба механизма обеспечивают резкое увеличение копий тех или иных белков, необходимых для реализации клеточного метаболизма.

Известно, что в клетках эукариот ДНК, соединенная с белками (гистонами), упакована в иуклеосомы. В этом состоянии транскрипция невозможна, и лтя экспрессии генов необходимо деблокирование транскриптона. Следовательно, образование и разрушение нуклеосом является важным фактором регуляции эукариотических генов. Каким же образом происходит деблокирование транскриптона?

Фосфорилирование гистонов. В результате действия белковых гормонов происходит опосредованное фосфорилирование ядерных белков — гисгонов и разрушение нуклеосом. Матрица при этом становится доступной для основных факторов инициации транскрипции, и начинается синтез РНК. При прекращении действия гормонов иуклеосомы восстанавливаются.

Апетилирование и деацетилирование гистонов. Это важный фактор регуляции генной активности. Оказалось, что фермент гиетон-ацетил аза ассоциирована с фактором ТАФ. Ацетилирование проходит по терминальному остатку лизина в полипептидной цепи гистона. В результате ацетилиро-вания положительный заряд белка уменьшается и сродство гистона к отрицательно заряженной ДНК снижается.

Это может привести к разрушению нуклеосом и деблокированию транскриптона.

Деацетилирование гистонов приводит к противоположному эффекту. Специфические ацетилаза и деацети-лаза ассоциированы с белками инициации транскрипции.

Регуляториыми элементами являются белки инициаториого комплекса. В дополнение можно отметить особые нуктсотадные последовательности, способствующие интенсификации транскрипции, так называемые энхансеры.

Характерная особенность этих структур заключается в том, что они влияют на скорость транскрипции независимо от локализации в оперопе. Белки, взаимодействующие с энхансерами, называются энхансерными элементами, расположенными на расстоянии 1000—2000 пар оснований от региона промотора. Эти белковые факторы способны воздействовать на инициацию транскрипции благодаря образованию ДНК-петли, что приводит к пространственному сближению энхансерных элементов и. например, белков TATA.

Весьма существенным фактором регуляции транскрипции является процессинг РНК. Образование зрелых мРНК зависит от скоростей кэширования, образования поли А, а также скорости сплайсинга. Для мРНК определенное регулягорное значение имеет альтернативный сплайсинг.

Кроме белков инициаторного комплекса, на скорость транскрипции оказывают существенное влияние ДНК-связывающие белки. Из нескольких семейств наиболее известны белки типа: цинковые пальцы, спираль—виток—спираль и гомеодоменные белки. Специфическое связывание этих белков с ДНК происходит в результате взаимодействия боковых радикалов аминокислотных остатков белка с основаниями ДНК.

Цинковые пальцы представляют собой серию повторяющихся доменов (от двух до девяти), имеющих форму пальца. В центре координации каждого домена находится цинк. В одних случаях цинк соединен с четырьмя остатками цистеина, в других — с двумя цистеинами и двумя гистидинами.

На конечный результат — синтез белка — влияет также скорость транспорта РНК в цитоплазму. В цитоплазме мРНК, взаимодействуя с определенными белками, образует информосому своеобразное депо, из которого мРНК освобождается по мере надобности для синтеза белка. Скорость освобождения мРНК также является фактором регуляции белкового синтеза.

Скорость синтеза белка напрямую зависит от количества мРНК, которое определяется временем ее «полужизни» или стабильностью in vivo. Таким образом, факторы, влияющие на стабильность мРНК. являются регуляторами экспрессии генов и, как следствие, белкового синтеза. Одной из структур, определяющих стабильность мРНК, является полиА-последовательность на З'ОН-концс.

Лимитирующей стадией процесса трансляции является ее инициация. Наиболее подробно описан процесс изменения скорости инициации трансляции в результате фосфорилирования фактора инициации IF2. Реакция катализируется ферментом 1Р2-киназой, причем присоединение фосфатной группы инактивирует фактор инициации. Этот феномен был изучен на примере синтеза гемоглобина в рстикулоцитах. Сначала было установлено, что глобин синтезируется только в присутствии гема. Затем была выстроена вся система регуляции синтеза глобина. Оказалось, что активация 1Г9-киназы происходит за счет ее фосфорилирования цАМФ-зависимой протеинкиназой. Взаимодействие этой протеинкиназы с цАМФ и ее активацию блокирует гем, выполняя тем самым негативный контроль синтеза гемоглобина.

Регуляция синтеза белка осушсствляется также на стадии процессинга белка.

Модификации новосиптезированных пол и пептидов осуществляются при помощи соответствующих ферментов, активность которых, в свою очередь, находится под генетическим контролем. К этим модификациям относятся метилирование, фосфорилирование, гликозилирование, а также ограниченный протсолиз.

– – –

1. Обмен углеводов.

2. Обмен липидов.

3. Биосинтез аминокислот. Синтез белка.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Ильина Н.А.Физиология и биохимия растений: Учебное пособие / Н.А. Ильина, И.В.

Сергеева, А.И. Перетятко - Ульяновск-Саратов, 2013. - 335 с.ISBN 978-5-86045-613-6

2. Кошкин, Е. И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур: учебник / Е.

И. Кошкин. - М.: Дрофа, 2010. - 638 с.: ил. - (Учебники и учеб. пособия для студентов высш.

учеб. заведений). - ISBN 978-5-358-07798-0

3. Сергеева, И.В.Физиология растений с основами экологии: Учебное пособие / И.В.

Сергеева, А.И. Перетятко - Саратов, 2011. - 348 с.ISBN 978-5-7011-0740-1

4. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / под ред. Н.Н. Третьякова. М.

: Колос, 2005. - 639 с.ISBN 5-10-002915-3

Дополнительная

1. Биохимия: учебник / В. Г. Щербаков, В. Г. Лобанов, Т. Н. Прудникова. - 3-е изд., испр. и доп. - СПб.: ГИОРД, 2009. - 472 с.: ил. - ISBN 5-98879-008-9

2. Козьмина, Н. П. Зерноведение с основами биохимии растений: научное издание / Н. П.

Козьмина, В. А. Гунькин, Г. М. Суслянок. - М.: Колос, 2006. - 464 с.: ил. - (Теоретические основы прогрессивных технологий: биотехнология). - ISBN 5-10-0039.