Получение здорового посадочного материала ягодных культур

Плодовые и ягодные культуры, размножаемые вегетативно, в сильной степени поражаются вирусами и микоплазменными забо­леваниями. На яблоне выявлено 19 вирусов и микоплазм, на кос­точковых культурах — более 30, землянике — 27, малине — 25, смо­родине — 14, крыжовнике — 9 и т. д. Вредоносность этих заболева­ний может быть значительной: израстание на малине и реверсия на смородине могут вызвать полное бесплодие насаждений. Потери урожая малины в результате заражения мозаикой могут достигать 50 %, вишни от вируса некротической кольце вой пятнистости — 90, сливы от вируса шарки — 70...80, земляники от вирусов морщинистости и крапчатости — 40 %. Заражение клоновых подвоев яблони одним вирусом хлоротической пятнистости листьев яблони снижа­ет приживаемость зеленых черенков на 10...15 %, а заражение комп­лексом вирусов (ХПЛЯ + бороздчатость древесины яблони) — на 20 %. Единственный эффективный способ снижения вредоноснос­ти вирусных и микоплазменных заболеваний — использование вы­сококачественного посадочного материала.

Разработана современная технология получения безвирус­ного посадочного материала основных плодовых и ягодных культур (яблони, груши, сливы, вишни, земляники, мали­ны, ежевики, смородины и крыжовника). Эта технология включает следующие этапы:

отбор исходных внешне здоровых растений в полевых условиях;

предварительное тестирование отобранных растений на наличие наиболее распространенных и вредоносных вирусов методом иммуноферментного анализа (ИФА) с применением поли- и моноклональных сывороток;

основное тестирование выделенных по результатам ИФА расте­ний на древесных и травянистых индикаторах и их повторная про­верка методом ИФА;

оздоровление в случае необходимости полностью зараженных сортов от вирусов, микоплазм и других трудно искореняемых вре­дителей и болезней методами водной и суховоздушной термотера­пии, культуры апикальных меристем, хемотерапии в про­бирке и в грунте;

повторное тестирование полученных в результате оздоровления клонов;

закладка суперсуперэлитных (ССЭ) маточников и проведение комплекса мероприятий, предотвращающих перезаражение оздо­ровленных клонов.

Микроклональное размножение растений — на­дежный способ получения идентичного потомства, используемый для размножения ценных мутантов, гибридов, перспективных сор­тов и подвоев. Этот способ имеет большое значение при размноже­нии оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и декоративных растений. Основные достоинства: высокий коэффи­циент размножения; возможность работы в лабораторных условиях круглый год; размножение оздоровленных растений без контакта с внешней средой, что исключает вероятность перезаражения; воз­можность длительного хранения пробирочных растений, создания банка генотипов. Микроклональное размножение растений требу­ет специальных условий, которые могут быть созданы в лаборато­риях. Такие лаборатории успешно работают во многих институтах: БелНИИ Плодоводства (РБ), БГСХА (РБ),

Всероссийском селекционно-технологическом институте садовод­ства и питомниководства (Россия), Всероссийском НИИ селекции плодовых культур (Россия), Всероссийском НИИ садоводства им. И. В. Мичурина (Россия), Всероссийском НИИ генетики и селекции плодо­вых растений им. И. В. Мичурина (Россия), Мичуринском государственном аграрном университете (Россия) и др.

Из оздоровленного растения ценного клона вычленяют эксп­лантат (трансплантат). В качестве источника эксплантатов при культивировании в стерильных условиях используют вегетативные и генеративные органы супер-суперэлитных тестированных расте­ний. В зависимости от поставленных целей это могут быть почка, апикальная часть стебля, корня, цветка или другого органа, из кото­рых получают каллусные ткани с последующей индукцией из них адвентивных побегов. Обычно при микроклональном размноже­нии используют боковые и верхушечные почки, а также оздоров­ленные меристематические растущие верхушки почек. Желательно брать апикальные почки весной, в период начала активного роста побегов. Меристематическая верхушка состоит из собственно ме­ристемы и двух-трех примордиальных листочков.

Почки можно брать с растений как из открытого грунта, так и из теплицы. После отделения от исходного растения почки необходи­мо промыть проточной водой в течение 1...2 ч и сполоснуть дистил­лированной водой. Для освобождения от сапрофитной микрофло­ры материал стерилизуют. Для этого обычно используют растворы диацида (0,1 %), сулемы (0,1 %), спирта (70 %), гипохлорита натрия или кальция, йода (0,01 %), нитрата ртути (0,2 %). Применяют про­стую стерилизацию (один стерилизующий агент) или ступенчатую стерилизацию (несколько стерилизующих агентов).

Работу ведут в боксах с установленными ламинарами, что обес­печивает высокую стерильность. Меристематическую верхушку вычленяют под бинокуляром при 30... 40-кратном увеличении спе­циальными инструментами, которые предварительно стерилизуют в течение 1,5...2 ч при температуре 120 "С. При работе после каждой операции инструмент стерилизуют (обжигают на спиртовке). Посу­ду (колбы, чашки Петри) автоклавируют, фольговые пробки обжи­гают. Эксплантаты помещают на поверхность агаризованной среды без заглубления.

Существует много питательных сред, различающихся в основ­ном по минеральному составу. Наибольшее распространение полу­чила среда по рецепту Мурасиге-Скуга с высоким содержанием азо­та (аммония) и калия. В Мичуринском государственном аграр­ном университете (МГАУ) для микроклонального размножения клоновых подвоев яблони используют среды Мурасиге-Скуга и Кворина-Лапорье. Минеральный состав сред дополняют сахаро­зой, агар-агаром, тиамином, никотиновой кислотой, пиридоксином, мезоинозитом, рибофлавином, глютатионом, аденином, вво­дят физиологически активные вещества цитокининовой и ауксиновой природы. Чаще всего применяют 6-бензиламинопурин (6-БАП). Иногда используют цитокинин в сочетании с ауксинами (ИМК, ИУК) в соотношении 3:1. На стадии укоренения цитокини-ны исключают.

Регенерация эксплантата происходит в три этапа: размножение (пролиферация), рост побегов (удлинение) и укоренение.

Меристематические верхушки, взятые в качестве источника экс­плантатов, при культивировании на искусственных питательных средах через 2 нед после введения в культуру начинают развиваться. Вначале растут примордиальные листья. За 4 нед культивирования они могут достигать длины 0,3...0,5 см и ширины 0,2...0,4 см. Через 4...5 нед. эксплантат переносят на свежую питательную среду (осу­ществляют пассаж). Пересадки проводят в стерильных условиях. При пересадке эксплантатов после первых двух-трех пассажей культивирования срез обновляют, удаляют раневой каллус. Начи­ная со второго пассажа, эксплантаты формируют дополнительные почки, т. е. наблюдается процесс пролиферации. При пересадке почки разделяют. За время одного пассажа при микроклональном размножении вишни от одного растения получают 5...10 побегов, пригодных к укоренению. Всего можно делать 5...6 пассажей; при этом коэффициент размножения достигает 625... 10 000, выход про­бирочных растений — 600...8000 за год.

Присутствие в питательной среде 6-БАП, применяемого для пролиферации пазушных почек и побегов, препятствует процессам ризогенеза. Для получения растений с корневой системой вводят специальную фазу культивирования, в ходе которой осуществляет­ся индукция корнеобразования у размноженных побегов. Для хоро­шего укоренения длина побегов яблони и груши должна быть не менее 2 см. Для этого побеги пересаживают на среды с пониженным содержанием 6-БАП и культивируют в течение 3...5 нед. Наиболь­шую эффективность в индукции ризогенеза обеспечивает исполь­зование риндолилмасляной кислоты (ИМК), которой можно об­рабатывать непосредственно побеги, но чаще ее вводят в питатель­ную среду.

Укореняемость подвоев вишни достигает 80...100 %, сортов виш­ни — 70...80 %, подвоев яблони селекции МГАУ— 70...100 % при концентрации ИМК 0,5...1 мг/л.

После того как в пробирке получено полностью сформирован­ное растение с хорошо развитым стеблем длиной 30...35 мм, с листь­ями, с корневой системой из 3...4 корней длиной 4...7 мм, его необ­ходимо перенести в нестерильные условия, т. е. осуществить адап­тацию. Это один из самых сложных этапов в системе микроклонального размножения. Адаптацию следует начинать не раньше конца февраля, лучше в марте. До начала массовой адаптации про­бирочные растения можно несколько месяцев хранить в холодиль­ной камере при температуре 2...4 °С.

Чтобы пробирочное растение при перенесении из стерильных в нестерильные условия лучше адаптировалось к жестким условиям внешней среды, субстрат (смесь низового нейтрального торфа и песка в соотношении 3:1) предварительно стерилизуют путем про­гревания в течение 2...4 ч при температуре 85...90 °С, а затем выдер­живают не менее 2 нед для восстановления микробиологической активности почвы. Субстратом заполняют торфяные горшочки раз­мером 5х5 или 8х10 см. Перед высадкой в субстрат корни расте­ний погружают в 1 %-ный раствор КМп04, чтобы уменьшить инфицированность в нестерильных условиях.

Горшочки с растениями устанавливают в ящики, которые зак­рывают полиэтиленовой пленкой и помещают на стеллажи под лю­минесцентные лампы (освещенность 2000 лк). Через 7...10 дней пленку снимают, проводят регулярный полив, каждые 10 дней под­кармливают растения растворимыми минеральными удобрениями (до 2 г/л). Через месяц хорошо развитые растения пересаживают в горшочки большего размера. Через 3 мес при правильном уходе ра­стение достигает высоты 20...30 см. Выход растений при адаптации составляет 65...80 %. Полученный супер-суперэлитный посадоч­ный материал используют для создания суперэлитных (безвирус­ных) маточных насаждений (рис. 1).