Лабораторная диагностика, характер исследуемого материала

Для диагностики ВИЧ-инфекции проводят серологические, вирусологические, молекулярно-генетические и иммунологичес­кие исследования.

Серологический метод является наиболее доступным для прак­тических лабораторий. Он заключается в обнаружении в испытуемой сыворотке специфических антител к антигенам ВИЧ, реже выявляют присутствие ВИЧ-антигенов.

Антитела появляются через 1-3 месяца после инфицирования и обнаруживаются на всех стадиях ВИЧ-инфекции, При развитии СПИ­Да их титр значительно снижается.

Основной диагностической реакцией для обнаружения антител является ИФА. Разработаны различные тест-системы ИФА, в том чис­ле более совершенные системы 3-4 поколения. Постановка ИФА в зна­чительной степени автоматизирована.

Обычно вначале проводят быстрое скрининговое исследование испытуемой сыворотки. При обнаружении антител к диагностикуму ВИЧ, сыворотку исследуют дважды, используя разные серии диагностикума или различные тест-системы. При положительном результате (даже в одной пробе), который считается предварительным, проводят подтверждающее экспертное исследование. Это необходимо, так как бывают ложноположительные реакции. Подтверждающую проверку проводят методом иммуноблотинга (вестерн-блот), выявляя наличие специфических антител к гликопротеинам gр120 и gр41, а также бел­кам р24 и р21. Реакция считается положительной при наличии анти­тел хотя бы к одному белку оболочки ВИЧ и к одному белку сердцевины вируса, например gр41 и р24.

Методом ИФА возможно выявить ВИЧ-антигены в крови и лимфоцитах в более ранние сроки, чем антитела, однако это удает­ся не всегда.

Молекулярно-генетический метод. Используют ГЩР для опре­деления провирусной ДНК в мононуклеарах крови. Эта качественная проба дает возможность обнаружить ВИЧ через 2-3 недели после зара­жения.

Разработана также количественная ПЦР, выявляющая концент­рацию вирусной РНК в плазме крови (тест вирусной нагрузки). Этот тест определяет количество копий РНК/мкл и позволяет прогнозиро­вать течение ВИЧ-инфекции, рекомендовать сроки начала специфиче­ского лечения и следить за его эффективностью.

Иммунологические исследования. Обследуют состояние иммун­ной системы организма (иммунный статус). Снижение количества Т4-лимфоцитов до 400-500 клеток/мкл, коэффициент соотношения Т4/ Т8-лимфоцитов ниже 0,6, а также резкое повышение количества IgА, IgD, IgЕ и циркулирующих иммунных комплексов, являются косвен­ными доказательствами наличия ВИЧ-инфекции.

Диагностика ВИЧ-инфекции у новорожденных затруднена. С первых дней жизни и в течение нескольких месяцев у них в крови могут циркулировать специфические антитела класса IgD, получен­ные пассивно от ВИЧ-инфицированной матери, что не является дока­зательством зараженности ребенка. Поэтому на первом году жизни у ребенка выявляют ВИЧ-антигены, определяют присутствие провирус­ной ДНК с помощью ПЦР или выделяют вирус в культуре клеток. Так­же диагностическое значение может иметь выявление антител класса IgА и повышение их титра.

7. Особенности вирусологического метода диагностики (культивирование, индикация, идентификация вируса)

Вирусологическое исследование заключается в выделении ВИЧ из биологических жидкостей и лимфоидных клеток обследуемого че­ловека на различных культурах клеток (линии клеток Н2, MOLT, СЕМ и др.). Это трудоемкий дорогостоящий метод, доступный для специ­альных лабораторий, применяемый, главным образом, для научных и эпидемиологических целей, реже для диагностики ВИЧ-инфекции (в основном - у детей).

8. Противовирусный иммунитет - нет

При попадании ВИЧ-инфекции в организм, иммунитет сразу же активизируется. Начинают вырабатываться CD8+ Т-лимфоциты, которые пытаются вывести вирус из организма. На время они даже блокируют развитие болезни, а также контролируют ее распространение в организме.

Однако со временем эти клетки иммунитета сами уничтожаются инфекцией, а, следовательно, их число резко уменьшается, что приводит к острому периоду ВИЧ-инфекции, постепенно переходящей в СПИД.

Клетки иммунитета, а в первый черед с вирусом начинают борьбу CD4+ Т-лимфоциты, быстро разрушаются. Инфекция воздействует и на структуру клеток, в результате чего они слипаются, образуя синцитии. Такие новые образования подвержены разрушению, т.к. их начинают атаковать клетки иммунитета человека. Происходит так называемый аутоиммунный сбой, когда лейкоциты не распознают вирусы и атакуют себя.

9. Специфическая профилактика

Общие меры профилактики аналогичны применяемым при гепа­тите В, гепатите С и других инфекциях, передающимся половым путем.

Специфическая профилактика ВИЧ-инфекции отсутствует. Ве­дутся интенсивные исследования по получению эффективных вакцин.

10. Этиотропное лечение

ВИЧ-инфекция не поддается окончательному излечению имею­щимися лекарственными средствами. Поэтому основной целью лече­ния является максимально возможное продление и улучшение качества жизни больного с сохранением его работоспособности, а при возник­новении вторичных заболеваний — замедление их развития и сниже­ние тяжести.

Лечение ВИЧ-инфекции является комплексным и включает антиретровирусную терапию, направленную непосредственно на воз­будителя, иммунокоррегирующую терапию посредством иммуномодуляторов, лечение оппортунистических инфекций и опухолей соответствующими антибиотиками, химиопрепаратами, облучением.

Антиретровирусная терапия осуществляется химиопрепа­ратами, нарушающими репродукцию вируса. Многие из них являют­ся токсичными, требуют 2-3 кратного ежедневного приема и длительных повторных курсов лечения. Как правило, это дорогостоя­щие препараты. В лабораториях мира проводится постоянная работа по получению эффективных, менее токсичных и более удобных для применения химиопрепаратов.

В России разрешены к применению 15 антиретровирусных пре­паратов, среди них два - отечественного производства.

Антивирусные препараты отличаются по химическому составу и механизму действия, их можно подразделить на группы.

1. Ингибиторы обратной транскриптазы - нуклеозидные и нуклеотидные аналоги. Эти препараты встраиваются в нить ДНК, фор­мирующуюся при участии обратной транскриптазы на вирусной РНК-матрице и блокируют синтез ДНК. Тем самым нарушается процесс обратной транскрипции, а, следовательно, и репродук­ция ВИЧ. Различают нуклеозидные аналоги тимидина и аналоги других нуклеозидов.

Производные тимидина: - Азидотимидин (АЗТ, Зидовудин, Ретровир, Тимидин - производства России);

- Ставудин (зеритл-Никавир;

- Фосфазид (Россия) - (фосфорилированный АЗТ, менее токсичен, дольше не выводится из организма. Производные других нуклеозидов:

- Диданозин (Видекс) - производное аденина;

- Зальцитабин (Хивид,- Ламивудин (Эпивир) – производные цитозина;

- Абакавир (Зиаген) - производное гуанина.

Комбинированный препарат — Комбивир (Зидовудин + Ламивудин).

2. Ингибиторы обратной транскриптазы - ненуклеозидные аналоги. Препараты соединяются с активным центром обратной транскриптазы и блокируют ее.

- Невирапин (Вирамун); Ифавиренц (Стокрин).

К этим препаратам быстро формируется лекарственная устойчи­вость ВИЧ, поэтому их применяют в комбинации с антивирусными препаратами из других групп.

3. Ингибиторы протеазы ВИЧ. Препараты обладают высокой ток­сичностью, требуют 3-х кратного приема в сутки совместно с пищей, соблюдения диеты. Это самые дорогостоящие препара­ты. Все это ограничивает их применение.

- Санквинавир (Фортоваза);

- Индинавир (Криксиван);

- Нельфинавир(Вирасепт);

- Ритонавир (Норвир)

Выявлено, что при приеме одновременно двух препаратов, инги­биторов протеазы, из которых один Ритонавир, лечебная доза препа­ратов значительно снижается. Ингибиторы протеазы обязательно комбинируют с антиретровирусными препаратами из первой группы.

Таким образом, основными антивирусными препаратами для лече­ния ВИЧ-инфекции являются ингибиторы обратной транскриптазы - про­изводные тимидина. Только они пригодны для монотерапии - лечения одним препаратом. Более эффективно их совместное применение с препаратами той же группы - производными других нуклеозидов, то есть битерапия. Еще более интенсивной является тритерапия, при которой к этим двум пре­паратам добавляют третий - ингибитор обратной транскриптазы с иным механизмом действия (ненуклеозидный аналог) или ингибитор протеазы. Иногда используют схему лечения четырьмя препаратами.

Совместное применение нескольких препаратов уменьшает риск возникновения лекарственной устойчивости ВИЧ.

Антивирусную моно- или битерапию ВИЧ-инфекции проводят во 2-й стадии заболевания при возникновении ранних клинических проявлений, например: неосложненных или с присоединением вторичных оппортунис­тических инфекций. После нормализации состояния и значительного повы­шения количества СD4⁺-лимфоцитов/мкл лечение прекращают.

Лечение возобновляют в конце 3 стадии (латентной), применяя интенсивную терапию несколькими антивирусными препаратами. По­казанием к возобновлению лечения служит снижение количества СD4⁺-клеток/мкл и присоединение оппортунистических инфекций. Лечение проводят 12-недельными курсами с перерывами во время ремиссий до конца жизни больного.

III. План практической работы

1. Учесть и обосновать заключение по РПГА, поставленной с целью обнаружения НВs-антигена, в диагностике гепатита В

Метод диагностики: вирусологический

Компоненты: вирусологический материал (исследуемая сыворотка больного для обнаружения НВs-антигена), антительный эритроцитарный диагностикум (содержащие эритроциты с адсорбированными на них антителами к НВs-антигену).

Постановка: В рабочую лунку вносят вирусологический материал (сыворотку больного) и антительный эритроцитарный диагностикум. Выдерживают при комнатной температуре в течение 40 мин.

Учет: Положительная реакция – осадок с неровными краями в виде красного зонтика. Отрицательная реакция- осадок с ровными краями в виде красной пуговки. Титр РПГА определяют по максимальному разведению, при котором наблюдается гемагглютинация (красный зонтик)

Заключение: Сыворотка больного содержит НВs-антиген, что свидетельствует об начальной стадии гепатита В.

2. Нарисовать схему лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

А) серологическое исследование (выявление анти-ВИЧ-антител)

Б) вирусологическое исследование (обнаружение вирусных антигенов)

Сыворотки больных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 содержат антитела ко всем вирусным белкам. Однако для подтверждения диагноза определяют антитела к белкам gp41, gp120, gp160, p24 у ВИЧ-1 и антитела к белкам gp36, gp105, gp140 у ВИЧ-2. ВИЧ антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ-инфекции. Для выявления специфических антител используют ИФА, для подтверждения диагноза ставится иммуноблотинг (иммуноблот, Western blot, вестерн-блот).

В более ранние сроки выявляются антигены ВИЧ. Наличие вирусемии определяют с помощью ПЦР- диагностики (качественное определение ДНК ВИЧ в мононуклеарах периферической крови). С помощью обратной ПЦР проводится количественное определение РНК ВИЧ-1 в крови, что позволяет прослеживать уровень вирусной репликации при естественном течении этого заболевания и осуществлять контроль за результатом противовирусного лечения. Метод выявления вируса в крови, лимффоцитах превосходит по информативности другие тесты, однако он трудоемок и дорог.

3. Учесть и обосновать заключение по результатам иммуноблотинга

Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА (рис. 30). Смесь антигенов микроорганизма (родовых, видовых, групповых) разделяют на фракции, содержащие отдельные антигены с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле. Затем переносят его (блоттинг - от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блоттами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплексы антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека, меченое ферментом, выявляют до­бавлением субстрата и хромогена, изменяющих окраску под действием фермента. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции, сифилисе, листериозе и других инфекциях.

Рис. 30 Схема иммуноблоттинга