Измененные жирные кислоты

Учитывая роль измененных жирных кислот в патогенезе дисбаланса типаD, особенно обусловленного облучением, было предпринято исследование препаратов кислых липидов, полученных из измененных тканей, органов или организмов. Первую из исследованных групп составили животные, умершие от лучевой слабости, шока, острых инфекций или после перенесенной адреналэктомии. В большом количестве экспериментов в качестве источника измененных липидов были использованы морские свинки, инфицированные B. Anthracis, и мыши, инфицированные гемолитическим стрептококком. Были использованы кислые липиды, полученные из аутолизатов тканей. Мы также применяли жирные кислоты, полученные из жира печени трески и масла сардин, которые могут рассматриваться в качестве соответствующих не естественным, а поврежденным жирным кислотам, поскольку они были получены путем аутолиза целой печени трески и целых сардин.

После того, как определили, что конъюгация двойных связей составляет основу нарушений в патогенных жирных кислотах, были приготовлены и изучены конъюгированные изомеры разных жирных кислот. Элеостеариновая кислота, полученная из тунгового масла, широко применялась в исследованиях на животных и испытаниях в клинике. Parinaric acid была получена из орехов parinarium laurinum и применялась меньше. Разные конъюгированные жирокислотные изомеры, распознанные при проведении спектрального анализа и по индексам щавелевой кислоты, были получены в большом проценте в разных жирокислотных препаратах путем использования модификации классических методов конъюгации. (Заметка 3) Многие смеси естественно встречающихся жирных кислот, обнаруживаемых в омыляемых фракциях, были конъюгированы указанным методом. Конъюгированные ди, три, тетра, пента—и гексаенные жирные кислоты были в дальнейшем выделены из указанных смесей и изучены. Интерес представила обнаруженная связь указанных конъюгированных жирных кислот с кислородом. Если воздействие кислорода на линолевую кислоту при температуре 37°C приводит к постепенному увеличению количества присутствующих перекисей, этого не происходит в случае конъюгированного изомера(Рис123), очевидно вследствие повторяющихся разрушений образующихся перекисей.

Обычно, эффекты, производимые конъюгированными жирными кислотами на разных уровнях организации, более интенсивны и дольше персистируют, чем те, которые получены из неконъюгированных изомеров. Здесь интересно отметить влияние, оказываемое этими препаратами на вирусы. Хотя на бактериофаги влияния не оказывается, в условиях in vivo заметно влияние на восприимчивость организма к вирусам. Подкожная инъекция конъюгированных жирных кислот кролям создает область рефрактерности по отношению к инокуляции кожной вакцины вируса оспы, более и дольше выраженную, чем та, что наблюдается при использовании неконъюгированных изомеров. Отмечен также вполне определенный эффект в отношении микробов: грамотрицательные штаммы с явными морфологическими изменениями были получены из B. anthracis и персистировали как таковые в течение 6-15 пассажей, перед тем как вернулись прежние морфологические и тинкториальные характеристики. Воздействие на клетки красной крови и лейкоциты in vitro было более явным, чем у соответствующих неконъюгированных изомеров. Отмеченное выше, также справедливо в отношении влияния на дыхание тканей или клеток асцита in vitro.

Различие в эффектах конъюгированных и неконъюгированных жирных кислот особенно поразительно в некоторых проявлениях. Например, боль кислотной модели легче меняется на щелочную при воздействии жирных кислот, чем неконъюгированных изомеров. Если щелочная модель возникает, она персистирует продолжительное время. Явный результат воздействия наблюдается в отношении поражений, вызванных облучением. Стандартизированные лучевые раны у крыс, заживающие у контрольных животных через четыре недели и требующие для своего заживления от шести до восьми недель при лечении препаратами неконъюгированных жирных кислот, не заживали вообще при лечении соответствующими дозами конъюгированных изомеров этих же жирных кислот.

'i

Рис. 122. Спектральный анализ жирных кислот тела крыс (целиком) после того, как проведения химическая изомеризация показывает наличие двух и трех triethenic членов и немного членов с большим числом двойных связей. (0.002% в этиловом спирте)

Рис. 123. Кривые перекисных проб линолевой кислоты (a) и ее конъюгированного изомера (b), индуцированные прохождением кислорода (100 мл за минуту) через 30 см³ пробы при температуре 37°C. Поскольку перекиси постепенно накапливаются в препарате линолевой кислоты, они не меняются в конъюгированном изомере.

Изомеры жирных кислот также различаются по их воздействию на животных, находящихся в состоянии шока, когда анестезированные животные ошпариваются путем погружения до уровня мечевидного отростка в воду при температуре 90 °C. Происходит немедленный шок, если погружение длится более четырех секунд. При трехсекундном ошпаривании животные погибают на протяжении несколько часов. Назначение препаратов жирных кислот заметно сокращает время выживания. Указанный эффект более очевиден для конъюгированных членов, особенно для элеостеариновой кислоты. В общем, животные в состоянии шока, вызванного любым способом, таким как эксперимент в барабане Noble-Collip, обнаруживали особую чувствительность по отношению к препаратам конъюгированных жирных кислот.

Действие конъюгированных жирных кислот на системном уровне, по данным анализов крови и мочи, оказывается в том же направлении, что и у неконъюгированных, но более выражено.

Наблюдаются значительные различия эффектов конъюгированных и неконъюгированных жирных кислот на развитие пересаженных и спонтанных опухолей. У небольшой части мышей удалось предотвратить появление опухолей, индуцированных метилхолантреном, смесью неконъюгированных жирных кислот, полученных из жира печени трески или масла сардины. Конъюгированные жирные кислоты полученные при обработке указанных препаратов, продемонстрировали этот профилактический эффект у большей части мышей. Указанные эксперименты интересны с нескольких точек зрения и представлены подробно в Заметке 4.

Конъюгированные жирные кислоты приводили к увеличению содержания хлорида в ранах у животных. Значения величин оказывались на 40% выше, чем таковые при нелеченных поражениях. Идентичное увеличение хлоридов происходит в опухолях. Когда мыши с аденокарциномой Dba были пролечены в течение десяти дней препаратами конъюгированных жирных кислот, удалялись опухоли и измерялось содержание хлорида, то величины составляли до 180% от таковых у контрольных животных с нелечеными опухолями. (Заметка 5) Интересный эффект отмечен у опухолей крыс двух типов. На протяжении целого ряда лет при пассажах гереновской (Guerin) опухоли крысы и саркомы, индуцированных в нашей лаборатории путем инъекции бензпирена, обнаруживался их особый характер. Хотя они вырастали до больших размеров, некротических областей в них не отмечено. После проведения лечения конъюгированными жирными кислотами появлялись большие области некроза, осложнявшиеся изъязвлением и смертельным исходом. Появление указанных областей некроза обусловливается изменениями фундаментальных свойств опухоли. Трансплантаты фрагментов указанных леченых опухолей, хотя и взятых из областей, лишенных изъязвлений или из молодых опухолей, приобрели, в результате, раннее изъязвление в центральной области. Указанное явление сохранялось, без лечения, в последующих поколениях. Изъязвленные опухоли представляли собой мутацию исходных, а мутационные изменения можно было связать с воздействием конъюгированных жирных кислот. Это подтверждалось тем, что идентичные изменения устойчиво получались в этих же опухолях при использовании тех же средств. Такой же, но менее выраженный и постоянный, эффект получен при использовании препаратов жирных кислот из жира печени трески, назначавшихся повторно в больших количествах. Подобный эффект получен и при инъекции жирных кислот непосредственно в самой опухоли.

Под воздействием конъюгированных жирных кислот отмечаются заметные изменения в сторону щелочной реакции в рН струпа раны второго дня. Такой же явный эффект отмечен и в отношении времени регенерации печени. Клетки, заполненные жировыми капельками, не появляются вообще, или появляются много позже, чем у нелеченых контролей. У крыс весом 200 г, при достаточно большой дозе, такой как 2 см³ 10% раствора поликонъюгированных жирных кислот, полученных из жира печени трески, с повтором на протяжении двух дней, в надпочечниках установлено полное истощение жиров. Надпочечники приобретают малые размеры, красную окраску и не содержат суданофильного материала. Регенераты печени характеризуются наличием малых по размерам клеток, имеющих компактную цитоплазму и почти не содержащих жировых капелек.

Отмечается заметное воздействие конъюгированных жирных кислот в отношении лимфатической системы. Вслед за инъекциями препаратов конъюгированных жирных кислот, особенно смеси конъюгированных жирных кислот жира печени трески, отмечается заметная инволюция вилочковой железы, селезенки и лимфатических желез. Эффект в отношении опухолей непостоянен.

У некоторых животных заметна задержка, у других эффекта не отмечается. В отношении судорог эффект не больше, чем при применении неконъюгированных изомеров. Цвет крови in vitro представляется темнее, чем когда применяют другие жирные кислоты. После применения препаратов конъюгированных жирных кислот заметно снижается число эозинофилов. Важные изменения в органах были получены при повторных инъекциях соответствующих клеток, обработанных in vitro суспензиями указанных кислот. Изменения в анализах мочи, однако, не сильно отличаются от тех, что получены с неконъюгированными изомерами. При использовании достаточных количеств жирных кислот наблюдалась выраженная гипотермия.

Биксин

В эту же группу жирных кислот можно поместить и биксин, член политерпенового семейства с 9 конъюгированными двойными связями, который мы получили в результате омыления семян Bixa orellana и широко исследовали. Изменения, производимые у микробов, идентичны таковым, полученным с другими поликонъюгированными жирными кислотами. Особый интерес представляют изменения в соединительной ткани животных. Первой реакцией на подкожную инъекцию масляного раствора 1 % биксина у крыс и мышей является воспалительный процесс с раздроблением инъецированного материала на сотни мельчайших капелек. Некоторые, однако, тают, а неабсорбировавшийся инъекционный материал образует одну или две большие капли. Стенка, содержащая капли, очень тонкая и прозрачная, составлена из очень немногочисленных соединительнотканных клеток, имеющих чрезвычайно длинные фибриллы, представляющие наивысшую степень дифференцировки указанных клеток.

Воздействие на боль идентично таковому конъюгированных жирных кислот. рН струпа раны второго дня обнаруживает явный сдвиг в сторону алкалоза. Действие на лучевые раны идентично влиянию конъюгированных триенов. У животных, подвергшихся инъекциям судорожных доз тиамина, для предотвращения судорог оказалось достаточно всего нескольких миллиграммов препарата биксина. Из всех использованных препаратов жирных кислот, биксин оказался наиболее эффективным противосудорожным средством. Иодное число величиной 430, определенное для наших препаратов, вновь подтверждает, таким образом, наличие в указанном случае связи между противосудорожным действием и обогащенностью жирных кислот двойными связями.

Интересно распределение биксина после его назначения. Хроматографическое изучение составных частей крови после гидролиза показывает, что почти весь биксин сосредоточен в клетках красной крови, минимальные количества содержатся в плазме. Такие поражения, как раны или опухоли, после назначения биксина становятся особенно обогащенными указанным веществом, по сравнению с нормальными тканями. Также явно отмечаются изменения в развитии опухолей. Назначение указанного средства часто приводит к быстрому некрозу и отеку. У животных и людей мы наблюдали, как через несколько дней после применения всего нескольких миллиграммов этого вещества появляется изъязвление массивных опухолей. Язвообразующий эффект конъюгированных жирных кислот на опухоли достигает своего максимума на биксине. В опухолях животных, которые при успешных пассажах никогда спонтанно не изъязвляются, введение хозяину путем инъекции всего нескольких миллиграммов биксина в масляном растворе приводит, в дополнение к изъязвлению, к изменению опухоли, которое может рассматриваться в качестве мутации. Дальнейшие трансплантаты характеризовались постоянно изъязвляющимися опухолями с сохранением изъязвленного характера в последующих поколениях. Большие дегенеративные изменения были получены в органах после повторных подкожных инъекций суспензий клеток, полученных из указанных органов и леченных in vitro биксином.

Изменения в направлении дисбаланса D вызывали в разных системных моделях у людей сдвиги, которые производятся жирными кислотами. Тем не менее, однажды индуцированные, указанные изменения весьма устойчивы и часто не подвержены воздействию жирных кислот. Именно указанная характерная резистентность к дальнейшим изменениям представляет помеху для лечебного использования этого средства.

Угасающий ответ

В противоположность сравнительно длительно персистирующим изменениям, индуцированных биксином, поразительно кратковременный эффект в отношении боли или системных проявлений наблюдали при использовании препаратов жирных кислот, особенно конъюгированных изомеров. Более того, в начальном периоде их назначения указанные средства, даже в сравнительно малых дозах, производили интенсивное воздействие. Тем не менее, в дальнейшем подобный эффект не удавалось получить, если постоянно не увеличивать количество применяемого препарата. По прошествии определенного времени даже большие дозы оказывали очень слабый эффект.

Объяснение угасающего характера результатов, полученных при использовании указанных и многих других средств, можно найти в том, что организм защищает себя от любого фактора, способного нарушить его равновесие.. В случае с конъюгированными жирными кислотами указанная защита, вероятно, обеспечивается, главным образом, за счет надпочечников. E. F. Taskier изучил указанный аспект адреналовой защиты в нашей лаборатории, и это исследование представлено в Заметке 17, Глава 6. Адреналэктомированное животное обычно обладает меньшей сопротивляемостью по отношению ко многим назначенным средствам, по сравнению с нормальными или ложно-оперированными животными. Указанное падение сопротивляемости выражается в показателе адреналовой защиты, как отношение минимальной летальной дозы для нормального и адреналэктомированного животного. Для большей части препаратов жирных кислот указанный индекс составляет от двух до трех, с увеличением для конъюгированных жирных кислот. Жирные кислоты с тремя конъюгированными двойными связями, тем не менее, имеют индекс адреналовой защиты 120. Элеостеариновая кислота в 120 раз менее токсична для ложно-оперированных лабораторных животных контрольной группы, чем для адреналэктомированных животных, что указывает на существование особого защитного механизма в надпочечниках против указанных кислот. Таким образом, означенное угасающее действие можно объяснить прогрессивно увеличивающимся вмешательством надпочечников.

Альфа гидрокси жирные кислоты

Альфа гидрокси жирные кислоты были получены путем соединения гидроксила и углерода, соседствующего с карбоксилом. Некоторые из указанных кислот присутствуют в природе—незначительные количества в головном мозгу и коже, и в очень малых количествах в почках. В нашем исследовании они были изначально приготовлены из естественных источников, таких как головной мозг и кожа животных. Большинство исследований, тем не менее, проведено с использованием синтетических альфа гидрокси жирных кислот. Для нужд экспериментов у животных и людей мы использовали главным образом чистые синтетические альфа гидрокси жирные кислоты. Смеси указанных членов гомологического ряда, полученные при обработке жирокислотных препаратов, применялись также. У животных и людей альфа гидрокси жирные кислоты вызывают меньшие системные, органные, тканевые и клеточные изменения, чем соответствующие необработанные жирные кислоты. Тем не менее, мы должны отметить одно поразительное исключение – реакцию лимфосаркомы 6C3HED у мышей на назначение альфагидроксикаприловой кислоты. Хотя указанная опухоль всегда приводит контрольных животных к смерти через 10-12 дней, она исчезает у более чем 80% животных, леченных альфа гидрокси каприловой кислотой, даже если лечение назначается поздно, то есть когда опухоль уже достигла 1 см в диаметре, величины, обычно достигаемой за 2-3 дня до смерти. У некоторых животных, у которых опухоль не исчезла, ее рост так сильно замедляется, что время выживания увеличивается до трех и более недель. (Заметка 6)

Прочие альфа гидрокси жирные кислоты, стоящие рядом с каприловой кислотой, такие как альфагидрокси- капроновая и каприновая кислоты, не обнаруживают влияния на развитие указанной опухоли. Таких эффектов нам не удавалось получить ни с одной другой из насыщенных альфа гидрокси жирных кислот, содержащих цепь из 4-20 атомов углерода, ни с альфагидроксилинолевой или альфагидроксилиноленовой кислотами. Ни альфагидрокси-каприловая кислота, не иная из ее гомологического ряда, не оказывали какого-либо влияния на другие трансплантированные животным опухоли у мышей, опухоль Walker у крыс или спонтанные опухоли грудной железы у мышей.

Другие жирные кислоты

Затухающий эффект, наблюдавшийся у естественно встречающихся жирных кислот, представляет столь большую помеху для лечебного применения указанных веществ, что мы провели поиск гетерогенных жирных кислот, с которыми организм в норме не встречается и от которых он не готов защищаться. Это побудило нас изучить жирные кислоты, имеющие разные неполярные группы, а не те, что содержат нормальные и ненормальные составляющие. Поскольку большая часть указанных веществ была синтезирована в лаборатории, мы исследовали в существенно большем масштабе две естественные жирные кислоты, находящиеся в растениях и являющиеся достаточно гетерогенными, рицинолеиновую и кротоновую кислоты.

Рицинолеиновая кислота содержит в молекуле двойную связь между 9 и 10 и гидроксилом при двенадцатом атоме углерода, вместо второй двойной связи, определяющейся у линолевой и линоленовой кислот. В результате индукционного эффекта, исходящего от карбоксила по цепи, С₁₁ является положительным атомом углерода. Положительный характер усиливается соседней двойной связью между C₉ и С₁₀, и гидроксилом, связанным с C₁₂. С₁₁, таким образом, является очень сильно положительным. Мы связываем интенсивный местный алкалоз с последующим выделением воды, соответствующим щелочной водной диарее благодаря воздействию рицинолеиновой кислоты, освобождаемой в кишечнике и считали ее соответствующей местному органному дисбалансу, идентичному таковому, вызванному в тканях ненасыщенными жирными кислотами. Это объясняет интенсивное слабительное действие касторового масла.

Мы применили рицинолеиновую кислоту парентерально с целью получения идентичного эффекта при патологических клеточных или тканевых поражениях. Масляный раствор рицинолеиновой кислоты обладает низкой токсичностью при парентеральном назначении. Тем не менее, не получено явного воздействия на опухоли или на разных уровнях организации. Кротоновая кислота не показала ожидавшегося влияния на указанных уровнях.

Изучались другие гетерогенные агенты, полигидрокси жирные кислоты. Они готовились путем добавления одной, или больше, OH групп к двойным связям неполярных групп ненасыщенных жирных кислот. 9, 10 дигидрокси и 9, 10, 12, 13 тетрагидрокси жирные кислоты не отличались по вызываемому действию на боль, или системные анализы, у людей, или на рост опухоли у животных и людей.

Перекисные жирные кислоты

Перекиси и закиси жирных кислот были приготовлены и изучены. Они обнаружили более выраженное воздействие на вирусы и бактерии in vitro и in vivo, чем другие жирные кислоты. Исследование эффектов указанных жирных кислот в отношении более высоких уровней вплоть до настоящего времени было ограниченным. Выходит, что эффекты на системные и органные проявления несколько отличаются от таковых, полученных при использовании жирных кислот, от которых эти перекиси и закиси происходят. Влияние на боль и опухоли было более выражено для соответствующих жирных кислот. Указанное исследование—особенно с polyepoxide жирными кислотами—все еще продолжается.

Галогенные компоненты жирных кислот

Изучение изменений в поражениях, в которых присутствуют измененные жирные кислоты, показало важность фиксации хлоридных ионов в этих веществах. Учитывая его место в периодической системе, хлор представляет элемент с гетеротропической характеристикой. С этой точки зрения он может считаться антагонистом жирных кислот, уравновешивающим их гомотропический характер. Указанное положение было подтверждено фармакологическим исследованием жирных кислот, к которым ионы хлора были добавлены к двойным связям. Нас особенно интересовали конъюгированные жирные кислоты, у которых эффекты обработки хлором могли быть подтверждены при проведении спектрального анализа.

Когда смесь конъюгированных жирных кислот, полученная из жира печени трески, была обработанная хлором, пики в спектральном анализе поступательно исчезали. (Рис. 124) Это не приводило, как ожидалось, к увеличению токсичности. Более того, в дальнейшем в ранних испытательных исследованиях разные препараты, от 9-10 дихлоростеариновой кислоты до полихлоринированной смеси жирных кислот жира печени трески, не было показано воздействий, сильно отличающегося от таковых, свойственных конъюгированным жирным кислотам на развитие опухоли, системные анализы и боль. Ни в экспериментах на животных, ни при исследованиях на человеке, не было отмечено каких-либо отличий между производными и соответствующих им жирным кислотам.

Тем не менее, опыт использования указанных продуктов указывает на возможность вызывания ими изъязвлений в желудке, по нашему мнению, вследствие влияния жирных кислот на слизистую оболочку желудка, куда они помещаются ионами хлора, с которыми сильно связаны. Исследования, проведенные в указанном направлении, подтверждают роль указанных жирных кислот, прочно связанных ионами хлора, в патогенезе состояния шока.

Обобщенный анализ фармакологической активности, упоминавшихся выше, жирных кислот доказывает идентичность основных воздействий, оказываемых большинством указанных препаратов. Это может объясняться тем, что всем им свойственен липидный характер и одинаковая полярная группа с кислыми свойствами - карбоксил. В результате, указанные вещества занимают одно и то же место в измененных объектах, что представляет важнейший фактор их фармакодинамической активности.

РИС. 124. Влияние, оказываемое газообразным хлором на конъюгированные жирные кислоты. Показано параллельно происходящее снижение числа всех этих членов. (0.002% в этиловом спирте)

Дополнительными биологическими различиями между влиянием, оказываемым разными подвергнутыми изучению членами, являются те, которые связаны со вторичными эффектами указанных веществ вследствие влияния неполярных групп. Указанное наблюдение свидетельствует о том, что основная фармакологическая активность жирных кислот связана с местом активности, определяемым липоидическим характером и наличием полярной группы, в то время как истинная фармакологическая активность обусловлена неполярной группой, что не только имеет первостепенное значение для понимания действия указанных веществ, но и определяет путь дальнейших исследований. Поэтому мы исследовали, во второй этап, липоиды с иными отрицательными полярными группами.