Определение ферментации лактозы

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной колонии засевают в две пробирки с полужидкой лактозной средой и жидкой лактозо-пептонной средой (ЛПС).

В состав жидкой лактозо-пептонной среды(ЛПС) входят 10 г пептона, 5 г натрия хлорида и 5 г лактозы, которые растворяют при нагревании
в 1 л дистиллированной воды. После растворения всех ингредиентов
доводят рН до 7,4-7,6, разливают по 10 см³ в пробирки с поплавками,
стерилизуют 12 мин при температуре 112 °С.

Для приготовления среды накопления(концентрированной ЛПС), исполь­зуя титрационный метод, увеличивают количество всех ингредиентов (кроме воды) в 10 раз и разливают по 10 см³ во флаконы с поплавками.

Перед стерилизацией в ЛПС, используемую для подтверждения спо­собности бактерий к ферментации лактозы до кислоты и газа, добавляют 1,6% спиртовой раствор бриллиантового синего из расчёта 1 см³ красите­ля на 1 л ЛПС (при образовании кислоты зелёный цвет ЛПС изменяется на жёлтый). Для работы мембранным методом готовую ЛПС разливают по 3-5 см³ в пробирки с поплавками.

Для обнаружения ОКБ посевы в ЛПС с индикатором инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч. Для обнаружения ТКБ посевы инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа результат исследования считают положительным. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты через 24 ч пробирки оставляют в термостате до 48 ч.

При положительных результатах КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 см³ воды. Вычисления проводят по формуле:

Х= а×100/v,

где Х – число колоний в 100 см³;

а – число подсчитанных на фильтрах колоний в сумме;

v – объем воды, профильтрованный через фильтры.

Окончательный результат выдают в следующем формате: количество КОЕ ОКБ в 100 см³, из них – количество КОЕ ТКБ в 100 см³.

3. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

методом прямого посева

Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближённых к анаэробным, и подсчёте числа чёрных колоний. На первом этапе исследования пробу воды объёмом 20 см³ прогревают на водяной бане в пробир­ках при температуре 75 °С в течение 15 мин для уничтожения вегета­тивных форм микроорганизмов. Затем в 4 стерильные пробирки объёмом не менее 15 см³ вносят по 5 см³ подготовленной пробы воды и заливают горячим, расплавленным на водяной бане (не кипятить!) железо-сульфитным агаром по 10 см³ в каждую пробирку. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаж­дают в ёмкости с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при температуре 44 °С в течение 16-18 ч.

Количественному учёту подлежат те посевы, где получены изолиро­ванные чёрные колонии в толще питательной среды. Результат выража­ют числом КОЕ спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см³ воды. В случае сильного роста результат оценивают качественно и в протоколе отмечают: «Обнаружено в 20 см³ воды». При отсутствии роста чёрных колоний дают ответ: «Не обнаружено в 20 см³ воды».

Заключение _________________________________________________

4. Определение коли-фагов

Метод определения коли-фагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении их в среде обогащения на культуре Е. coli и последующем выявлением зон лизиса (просветления) газона Е. coli на питательном агаре. Метод предназначен дли проведения текущего контроля качества питьевой воды.

На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, при-готовленную следующим образом: эталонную тест-культуру Е. coli К-12 F⁺ Sm^r засевают в пробирку со скошенным питательным агаром. Через 18 ч инкубации при температуре 37 °С проводят смыв бактерий с косого агара 5см³ 0,9% раствором натрия хлорида и по стандарту мутности готовят взвесь Е. coli в концентрации 10⁹ бактериальных клеток в 1см³. Можно использовать 4-часовую бульонную культуру Е. coli, 2 см³ такой культуры содержат 10⁹ бактериальных клеток.

В начале исследования 100 см³ исследуемой пробы воды разливают на 6 объёмов: один фла­кон 50 см³ и 5 пробирок по 10 см³. В 50 см³ пробы воды добавляют 5 см³ питательного бульона 10-кратной концентрации (готовят путём увели­чения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке) и 0,5 см³ смыва (или 1 см³ 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli.

Дли контроля культуры 0,1 см³ смыва бактерий (или 0,2 см³ 4-часовой бульонной культуры) Е. coli помешают в чашку Петри и заливают ни питательным агаром. Посевы переносят в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение 18 ч.

После инкубации из объёма 50 см³ отмеряют 10 см³ в пробирку. Во все пробирки (6 объёмов пробы воды по 10 см³) добавляют по 1 см³ хло­роформа. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками, встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объёму воды и оставляют на 15 мин при комнатной температуре (Е. coli погибают, остаются только коли-фаги).

В 100 см³ расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара добавляют 1 см³ смыва суточной агаровой культуры Е. coli (в концентрации 10⁹/см² смыва) или 2 см³ 4-часовой бульонной культуры Е. coli. Приготовленную смесь разливают в чашки Петри: одну чашку для контроля культуры Е. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. После застывания агара чашки, пред­назначенные для посева пробы, делят на 6 секторов, маркируют каждый сектор в соответствии с исследуемыми объёмами и на каждый сектор наносят пастеровской пипеткой по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа) из 6 пробирок с пробой. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при температуре 37 °С на 18 ч.

Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают зоны лизиса в виде отдельного пятна или отдельной бляшки. Пробу счи­тают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице НВЧ БОЕ.

В протоколе анализа указывают НВЧ коли-фагов в 100 см³ воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ коли-фагов в 100 см³. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контроль­ной чашке результат считают недействительным.